膠原蛋白是一種生物高分子，它廣泛存在于動(dòng)物結(jié)締組織中，約占體內(nèi)蛋白總量的25%～30%，是哺乳動(dòng)物體內(nèi)分布最廣、質(zhì)量分?jǐn)?shù)最多的功能性蛋白。由于其良好的生物活性、生物相容性以及生物降解性，它在生物醫(yī)學(xué)、食品和化妝品等領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用[1]。膠原蛋白具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性，是當(dāng)下生物醫(yī)學(xué)、藥劑學(xué)、工業(yè)化學(xué)及材料學(xué)等研究的熱點(diǎn)之一。人源膠原蛋白的種類多且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，據(jù)統(tǒng)計(jì)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并且得到確認(rèn)的共有30種以上的膠原蛋白，其中占比較多、研究較為透徹的是Ⅰ型、Ⅱ型以及Ⅲ型膠原 蛋白[2]。從動(dòng)物組織提取膠原蛋白成分雖然已有很長(zhǎng)歷史，但是工藝復(fù)雜且單體分離較難，還可能攜帶病毒存在安全隱患，其產(chǎn)量較低不能滿足人們對(duì)膠原蛋白的巨大需求。相比之下，利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)膠原蛋白具有提取法不具備的優(yōu)點(diǎn)，產(chǎn)品穩(wěn)定性及安全性高。因此，該技術(shù)近年來(lái)發(fā)展迅速，已經(jīng)成功地進(jìn)行了商化業(yè)開(kāi)發(fā)與生產(chǎn)，各類相關(guān)研究也日趨深入。

　　1 膠原蛋白的結(jié)構(gòu)

　　膠原蛋白 由 原 膠 原 組 成，每 個(gè) 原 膠 原 都 有 一種特殊的 三 重 螺 旋 結(jié) 構(gòu)，由 3 條 α-螺 旋 的 肽 鏈 纏繞而成，長(zhǎng)度約為1000個(gè)氨基酸殘基;每條 α肽鏈通過(guò)左手螺旋纏繞，3條肽鏈一起形成一個(gè)大的右手螺旋結(jié)構(gòu)(圖 1)。膠 原 特 有 的 左 旋 α鏈 相 互纏繞構(gòu)成膠 原 的 右 手 復(fù) 合 螺 旋 結(jié) 構(gòu)，這 一 區(qū) 段 稱為螺旋區(qū)段，區(qū)段最大特征是氨基酸呈現(xiàn)(Gly-X-Y)n周期性排列，其中 X，Y 位置為脯氨酸(Pro)和羥脯氨酸(Hyp)的比例很高，約占25%，是各種蛋白質(zhì)中含量 最 高 的;膠 原 蛋 白 中 存 在 的 羥 基 賴 氨酸(Hyl)在其他蛋白質(zhì)中不存在。羥脯氨酸(Hyp)不是以現(xiàn)成 的 形 式 參 與 膠 原 的 生 物 合 成，而 是 從已經(jīng)合成的膠原肽鏈中的脯氨酸經(jīng)羥化酶作用轉(zhuǎn)化來(lái)的。

　　2 重組鼠膠原蛋白

　　1997年，F(xiàn)ukuda等[3]成功地將鼠IV 型膠原α1鏈全克隆并轉(zhuǎn)染到 CHO 細(xì)胞株進(jìn)行表達(dá)，但所得膠原蛋白以單鏈狀態(tài)居多，只有極少的三螺旋結(jié)構(gòu)，大多數(shù) 單 鏈 交 聯(lián) 成 不 規(guī) 則 的 高 級(jí) 結(jié) 構(gòu)。1999 年，Werten等[4]在畢赤酵母(Pichiapastoris)表達(dá)系統(tǒng)中成功分泌表達(dá)了大鼠Ⅰ，Ⅲ型膠原蛋白基因片段，分子質(zhì) 量 約 為 2.1×104 Da 的 片 段 表 達(dá) 量 高 達(dá)14.8g/L，但是沒(méi)有三螺旋結(jié)構(gòu)，也沒(méi)有發(fā)生羥基化。2002年，Bruin等[5]將一段分子質(zhì)量約 2.8× 104 Da的鼠Ⅰ型膠原α1鏈的螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)域克隆并轉(zhuǎn)化 到 多 形 漢 遜 酵 母 (Hansenulapolymorpha)NCYC495中進(jìn)行表達(dá)，由于酵母自身可以合成脯氨酸羥化酶(Prolyl4-hydroxylase，P4H)，對(duì)表達(dá)的膠原蛋白雖 然 具 有 一 定 的 羥 基 化 修 飾 能 力，但 是與天 然 膠 原 蛋 白 相 比，羥 基 化 并 不 充 分，僅 約65%。

　　3 重組人膠原蛋白

　　為了避免動(dòng)物來(lái)源產(chǎn)品所帶來(lái)的高風(fēng)險(xiǎn)和不確定性，以及能充分利用膠原蛋白和明膠的優(yōu)良特性，許多研究人員利用基因工程的技術(shù)，選用各種宿主細(xì)胞，如轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、昆蟲(chóng)細(xì)胞、細(xì)菌和酵母等生產(chǎn)重組人膠原蛋白和明膠，其產(chǎn)品安全性好、質(zhì)量穩(wěn)定，消除了傳統(tǒng)提取方法存在的病毒隱患，同時(shí)也改善了膠原蛋白和明膠的親水性及免疫排異性等問(wèn)題。

　　3.1 動(dòng)、植物表達(dá)重組人膠原蛋白Toman等[6]報(bào) 道 了 將 膠 原 蛋 白 基 因 片 段 和 αS1-乳腺酪蛋白特異性啟動(dòng)子基因片段轉(zhuǎn)化小鼠，通過(guò)轉(zhuǎn)基因鼠的分泌型乳腺生產(chǎn)全長(zhǎng)的人I型原膠原(Procollagen)。鼠乳中三螺旋結(jié)構(gòu)的可溶性同型三聚體質(zhì)量濃度達(dá)到8mg/mL。該產(chǎn)量雖然較高，但是氨基酸分析顯示其中的羥脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)只有正常水 平 的 40% ～45%。推 測(cè) 乳 腺 上 皮 細(xì) 胞 中P4H 的水平是其羥基化的主要限速步驟，如果轉(zhuǎn)入編碼 P4H 的基因就可以大大降低這種限制。理論上共轉(zhuǎn)化膠原蛋白和 P4H 對(duì)應(yīng)基因的動(dòng)物能夠產(chǎn)生大量的作為重組膠原來(lái)源的乳汁，其中存在的安全隱患依舊沒(méi)有消除。

　　3.2 微生物表達(dá)重組人膠原蛋白

　　3.2.1 國(guó)外研究人膠原蛋白進(jìn)展1997年，Vuorela等[13]成功利用畢赤酵母表達(dá)了人Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ型膠原蛋白全序列。大量研究表明膠原蛋白與關(guān)鍵酶 P4H 在宿主細(xì)胞的共表達(dá)是一個(gè)較好的策略。與膠原蛋白共表達(dá)，不僅促進(jìn)了宿主表達(dá)的 P4H 的亞基正確且高水平地組裝成具有活性的四聚體，同時(shí)也使得膠原蛋白能夠被 P4H 充分羥基化。研究表明：與膠原蛋白的共表達(dá)還能顯著提高 P4H 的半衰期，例如與Ⅲ型膠原蛋白共表達(dá)，其半衰期可顯著提高15倍;酵母共表達(dá) P4H 得到的膠原蛋白能折疊成正確的空間結(jié)構(gòu)，并能充分地被羥基化，并且表達(dá)量可達(dá)0.2～0.6g/L，但是不能夠分泌表達(dá)出細(xì)胞，只能積累在細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔。即使進(jìn)一步嘗試使用α-MF信號(hào)肽也只能夠極少量地提高其分泌量，同時(shí)又會(huì)減少Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)總量。通過(guò)分析產(chǎn)物，得到各重組蛋白的4-羥脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)與天然膠原蛋白一樣，并且能在體外正確組裝成膠原纖維。繼續(xù)對(duì)Ⅰ型膠原蛋白進(jìn)行研究，將肽鏈的 N 末端基因切除，利用先前的方法構(gòu)建重組酵母。結(jié)果表明：重組酵母表達(dá)得到的膠原分子其結(jié)構(gòu)、性質(zhì)等都接近于天然的膠原蛋白，同樣也能在體外組裝成膠原纖維，僅四基因的單拷貝重組子的膠原蛋白表達(dá)量就高達(dá)0.5g/L，比在同樣條件下表達(dá)Ⅰ型膠原蛋白提高了1.5～3倍。

　　3.2.2 國(guó)內(nèi)研究人膠原蛋白進(jìn)展范代娣等[17]采用 PCR 技術(shù)獲得人膠原蛋白基因片段，進(jìn)行拼接重組后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過(guò)高密度發(fā)酵方式 培 養(yǎng) 生 產(chǎn) 類 人 膠 原 蛋 白，其 表 達(dá) 量 達(dá) 到29.4%，并進(jìn)行了發(fā)酵條件和純化等多方面的研究。為了獲得不含 N 和 C 末端肽的單鏈全長(zhǎng)人膠原α1(Ⅲ)鏈(COL3A1)的高水平分泌表達(dá)，研究人員將人 COL3A1對(duì)應(yīng)基因的cDNA 克隆到畢赤酵母分泌表達(dá)載體 pPIC9K 中，并整合到畢赤酵母 GS115中[18]。SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析表明：未水解的重組 人 COL3A1(rhCOL3A1)被 分 泌 到 培 養(yǎng) 基中，并顯示出約130kDa的表觀分子質(zhì)量，這比理論值高1.4 倍。最 后，使 用 四 步 方 法 將 未 羥 基 化的rhCOL3A1純化至高于 90% 的 純 度。此 外，甲基噻唑基二苯基四氮唑溴化物實(shí)驗(yàn)表明低濃度的rhCOL3A1能 有 效 促 進(jìn) 幼 倉(cāng) 鼠 腎 細(xì) 胞 (BHK21)增殖。

　　唐云平等[25]通過(guò)在大腸桿菌中將類人膠原蛋白基因 與 人 脯 氨 酰-4-羥 化 酶(P4H)和 D-阿 拉 伯-1，4-內(nèi)酯氧化 酶 (ALO)共 表 達(dá)，構(gòu) 建 了 一 個(gè) 原 核表達(dá)系統(tǒng)來(lái) 生 產(chǎn) 羥 基 化 類 人 膠 原 蛋 白，并 且 研 究了5種不同的培養(yǎng)基以及誘導(dǎo)條件對(duì)該蛋白可溶性表達(dá)的影響。結(jié)果表明：當(dāng)重組細(xì)胞在 MBL培養(yǎng)基中生 長(zhǎng) 并 在 指 數(shù) 生 長(zhǎng) 期 中 期 由 0.1 mmol/LIPTG 誘導(dǎo)時(shí)，搖瓶獲得的目標(biāo)類人膠原蛋白的最高可溶性表達(dá)水平為(49.55±0.36)mg/L。采用葡萄糖補(bǔ)料策略，在 10L 的 臺(tái) 式 發(fā) 酵 罐 中，目 標(biāo)類人膠 原 蛋 白 的 表 達(dá) 水 平 可 提 高 到 260 mg/L。此 外，高 效 液 相 色 譜 分 析 顯 示：在 純 化 的 類 人 膠原蛋 白 中，超 過(guò) 10% 的 脯 氨 酸 殘 基 被 成 功 羥基化。

　　4 結(jié) 論

　　膠原蛋白由于其良好的生物相容性、降解性及其他生物活性，越來(lái)越受到人們的關(guān)注，通過(guò)基因工程生產(chǎn)膠原蛋白的方法也由于其安全性高、產(chǎn)量高和成本低等優(yōu)勢(shì)，逐漸成為研究熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外膠原蛋白的需求量正穩(wěn)步增長(zhǎng)，尤其是高質(zhì)量的膠原蛋白，其產(chǎn)品市場(chǎng)前景廣闊。因此，有關(guān)基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組膠原蛋白的研究也在不斷向前推進(jìn)。利用重組技術(shù)生產(chǎn)膠原蛋白雖然已經(jīng)取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但是目前制備的重組膠原蛋白的產(chǎn)量、結(jié)構(gòu)特性及純度仍有提升空間。

　　參考文獻(xiàn)：

　　[1] 齊曉玲，李賀先，王國(guó)昌，等.生物活性膠原蛋白及明膠形態(tài)的表征研究[J].離子交換與吸附，2010，26(1)：53-58.

　　[2] 米鈺，惠俊峰，范代娣，等.類人膠原蛋白生物相容性實(shí)驗(yàn)研究[J].西北大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2004(1)：66-68.

　　[3] FUKUDA K，HORIH，UTANIA，etal.Formationofre-combinanttriple-helical[alpha1(Ⅳ)](2)alpha2(Ⅳ)collagenmoleculesinCHO coils[J].Biochemicalandbiophysicalre-searchcommunications，1997，231(1)：178-182

　　《基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組膠原蛋白的研究進(jìn)展》來(lái)源：《發(fā)酵科技通訊》，作者：魏 春1，劉 春1，劉心雨1，張旭初2，王 歡2

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