食源性疾病的暴發(fā)與食品受食源性微生物污染密切相關。據(jù)文獻報道，在食源性疾病疫情中，由微生物引起的暴發(fā)事件起數(shù)和發(fā)病人數(shù)最 多[1]。不 僅 如 此，從食品安全長遠發(fā)展來看，農(nóng)獸藥殘留以及非法添加物等食品安全問題是國民經(jīng)濟發(fā)展到特定階段必然出現(xiàn)的問題，也會隨著國民經(jīng)濟的發(fā)展和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式的轉變而弱化，但是致病微生物卻將長期存在，并將是國民經(jīng)濟進一步發(fā)展后食品安全的主要問題[2]。要保障食品安全，離不開食品中微生物的精準檢測。出于對食品中微生物可能引起的食品安全問題的擔憂，人們一直在研究食品微生物檢測的相關技術，分子生物學相關技術就是研究的重點之一[3-4]。下面首先對分子生物學技術在檢測機構食品微生物檢測中的應用現(xiàn)狀進行總結。

　　1 分子生物學技術在檢測機構食品微生物檢測領域的應用現(xiàn)狀

　　根據(jù)國家食品安全監(jiān)督抽檢實施細則要求，我國目前各檢測機構一般采用國家標準來檢測判定食品中的微生物[5]。從當前的食品微生物檢測國家標準來看，對于致瀉大腸埃希氏菌的檢驗，GB4789.6-2016《食品安全國 家 標 準 食 品 微 生 物 學 檢 驗 致 瀉 大 腸 埃希氏菌檢驗》要求[6]，生化反應符合大腸埃希氏菌特征的菌落需要 進 行 PCR 確 認 試 驗;GB4789.12-2016《食品安全國 家 標 準 食 品 微 生 物 學 檢 驗 肉 毒 梭 菌 及肉毒毒素檢驗》要求[7]，對于肉毒梭菌的檢驗，生化反應符合肉毒梭菌的菌落需要進行毒素基因檢測，以確定肉毒梭菌具體 類 型;對 于 大 腸 埃 希 氏 菌 O157：H7/NM 毒力基因 的 測 定，GB4789.36-2016《食 品 安 全國家標準 食品微生物學檢 驗 大腸埃希氏菌 O157：H7/NM 檢驗》中規(guī)定此項檢驗屬于選做項目[8];對于諾如病毒的 檢 測，GB4789.42-2016《食 品 安 全 國 家標準 食品微生 物 學 檢 驗 諾 如 病 毒 檢 驗》則 要 求 采 用實時熒光 RT-PCR方法檢測[9]。

　　2 分子生物學技術在檢測機構食品微生物檢測領域應用的技術制約因素

　　隨著檢驗要求的提升和檢驗規(guī)模的擴大，食品微生物傳統(tǒng)檢測方法的缺點日益凸顯，如由于不可培養(yǎng)微生物的存在，僅依靠培養(yǎng)手段，在生物多樣性上不能反映微生物的真實狀況以及檢測周期長、檢測流程復雜、特異性不足等缺點[11]。盡管存在這些缺點，但是新的技術并未完全取代原有的技術，這是因為新的技術也存在各種缺 點。在 一 種 技 術 的 優(yōu) 越 性 未 得 到 完 全 確 認時，出于對食品安全的負責，監(jiān)管部門不得不繼續(xù)要求檢測機構采用原有的較為成熟的技術。制約分子生物學技術在食品微生物檢驗中應用的因素有很多，下面僅對相關技術制約因素進行簡單總結。

　　2.1 微生物死活的有效區(qū)分與傳統(tǒng)的微生物檢驗方法相比，采用分子生物學技術進行微生物檢驗可實現(xiàn)對不可培養(yǎng)微生物的鑒定，在這方面科學家進行了大量的研究并取得了一定的成果[12-13]。這是采用分子生物學方法進行微生物檢驗的優(yōu)點之一，但采用此方法進行微生物檢驗同樣存在不足之處，比如在食品微生物檢驗中應用最多的分子生物學技術是PCR技術，采用 PCR技術檢測食品微生物的主要缺陷是不能區(qū)分微生物的死活，從樣品中提取的微生物即使死掉其 DNA同樣能作為模板進行特異性擴增，因此在檢測過程中會出現(xiàn)假陽性結果。開發(fā)快速、準確的活菌檢測技術是食品微生物檢測領域的一大挑戰(zhàn)。當前國 內 外 一 些 科 學 家 在 開 發(fā) 利 用 PMA/EMA-PCR技術，根據(jù)他們的文章報道[14-15]，這項技術能消除死去的微生物對PCR擴增的影響，使擴增信號只來源于活的微生物，近年來這項技術已經(jīng)開始進行探索性應用，但由于PMA(疊氮溴化丙錠)、EMA(疊氮溴化乙錠)毒性較大，污 染 消 除 也 比 較 困 難，大 規(guī) 模 推 廣 應 用 難 度較大。

　　2.2 微生物難以有效富集的缺點如果想利用分子生物學技術對食品中的微生物進行快速檢測，菌體的富集分離技術必不可少。當前的菌體富集分離技術有離心分離技術、改良增菌培養(yǎng)基富集技術、膜分離技術及免疫磁性分離技術等，但這些方法大都存在一定的缺點。離心分離技術存在著粘附食品基質、大量細菌損失等缺點[16]。高質量的改良增菌培養(yǎng)基的研發(fā)比較困難。采用膜分離技術時分離后的菌體常濃縮于食品或濾膜上，還需要進一步洗脫和分離，并且洗脫效果嚴重影響著細菌的回收率[17]。使用免疫磁性分離技術時，由于食品基質復雜，微生物菌群復雜多樣，對于抗體的干擾較大，選擇的抗原靶標不特異，將導致 富 集 到 很 多 雜 菌，無 法 正 確 檢 測 到 目 標菌[18]。同時免疫磁性分離技術存在著成本高、需要預處理、不適合大體積樣品分離等缺點。

　　3 分子生物學技術在檢測機構食品微生物檢測領域的發(fā)展趨勢

　　3.1 傳統(tǒng)鑒定技術與分子生物學技術相結合實際上，現(xiàn)在利用分子生物學技術進行檢驗的國家標準基本就是將傳統(tǒng)鑒定技術與分子生物學技術相結合，比如致瀉大腸埃希氏菌、肉毒梭菌的檢驗。這些微生物的檢驗一般都是先進行增菌、生化反應鑒定然后再進行分子生物學鑒定，傳統(tǒng)的涂布平板法可以比較準確地對微生物數(shù)目進行定量，而分子生物學技術則可以對微生物進行快速定性，但在定量方面仍然存在不足，這種檢驗方法的好處是可以將兩種技術的優(yōu)勢結合起來，這也是未來分子生物學技術用于食品微生物檢驗的發(fā)展趨勢之一。

　　3.2 進一步挖掘現(xiàn)有技術的潛力如果能將現(xiàn)有技術的潛力進一步發(fā)掘，可能會產(chǎn)生巨大的應用價值。比如數(shù)字 PCR技術，這項技術具有能對樣品 DNA絕對定量的獨特優(yōu)勢，但當前的一個缺點就是價格太高，這大大限制了其應用。如果隨著科技的進步，這項技術的成本能夠降下來，那么此項技術的應用范圍會大大增加。再比如，如果能夠將 PMA 等染料與數(shù)字PCR技術相結合，則能夠實現(xiàn)對活菌的絕對定量。除此之外，微流控芯片、全自動 PCR 技術、液相芯片等技術也已經(jīng)展現(xiàn)出了各自的獨特優(yōu)勢[20-22]，需要進一步發(fā)掘這些技術的潛力加以推廣應用。

　　3.3 新技術的開發(fā)利用要利用分子生物學技術對食品中的微生物進行檢測，一些配套 的 技 術 也 必 不 可 少，如增菌培養(yǎng)富集技術、DNA 提取技術、菌體直接富集分離技術等，這些技術與最后的檢測結果密切相關。當前這些技術都有很大的發(fā)展空間，需要科學家們進行進一步的研究。如果我們能夠開發(fā)出高效率的沒有前增菌過程的菌體富集分離技術，再配套分子生物學技術，就可以真正實現(xiàn)食品微生物的快速檢測，這在發(fā)生食品安全事件時顯得特別重要，可以使我們更快地確定病原體。

　　4 展望

　　任何一種技術都有其缺點，但科學就是在不斷發(fā)現(xiàn)問題與解決問題中不斷取得進步。分子生物學技術作為當前生物學領域發(fā)展最快、應用最廣泛的領域，已經(jīng)在食源性病毒如諾如病毒的檢測中起著不可替代的作用，理應也能夠在食品微生物檢測領域發(fā)揮更大的作用。隨著分子生物學技術及其他技術的發(fā)展，食品微生物檢測技術必將迎來廣闊的發(fā)展空間。

　　參考文獻：

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　　[2]TzschoppeM，MartinA，BeutinL.ArapidprocedureforthedetectionandisolationofenterohaemorrhagicEscherichiacoli(EHEC)serogroupO26，O103，O111，O118，O121，O145andO157strainsandtheaggregativeEHECO104：H4strainfromready-to-eatvegetables[J].IntJFoodMicrobiol，2012，152(1-2)：19-30.

　　[3]張書泰，周斌，童星，等.醬油釀造過程中微生物多樣性分析方法研究進展[J].中國調味品，2019，44(2)：193-200.

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　　《分子生物學技術在檢測機構食品微生物檢測中的應用現(xiàn)狀、技術制約因素與發(fā)展趨勢》來源：《中國調味品》，作者：丁衛(wèi)平1，楊夕宇2，朱可瀅2，蔡雙鳳2*

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