食源性疾病的暴發(fā)與食品受食源性微生物污染密切相關(guān)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在食源性疾病疫情中，由微生物引起的暴發(fā)事件起數(shù)和發(fā)病人數(shù)最 多[1]。不 僅 如 此，從食品安全長(zhǎng)遠(yuǎn)發(fā)展來(lái)看，農(nóng)獸藥殘留以及非法添加物等食品安全問(wèn)題是國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展到特定階段必然出現(xiàn)的問(wèn)題，也會(huì)隨著國(guó)民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式的轉(zhuǎn)變而弱化，但是致病微生物卻將長(zhǎng)期存在，并將是國(guó)民經(jīng)濟(jì)進(jìn)一步發(fā)展后食品安全的主要問(wèn)題[2]。要保障食品安全，離不開(kāi)食品中微生物的精準(zhǔn)檢測(cè)。出于對(duì)食品中微生物可能引起的食品安全問(wèn)題的擔(dān)憂，人們一直在研究食品微生物檢測(cè)的相關(guān)技術(shù)，分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)就是研究的重點(diǎn)之一[3-4]。下面首先對(duì)分子生物學(xué)技術(shù)在檢測(cè)機(jī)構(gòu)食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行總結(jié)。

　　1 分子生物學(xué)技術(shù)在檢測(cè)機(jī)構(gòu)食品微生物檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀

　　根據(jù)國(guó)家食品安全監(jiān)督抽檢實(shí)施細(xì)則要求，我國(guó)目前各檢測(cè)機(jī)構(gòu)一般采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)來(lái)檢測(cè)判定食品中的微生物[5]。從當(dāng)前的食品微生物檢測(cè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)來(lái)看，對(duì)于致瀉大腸埃希氏菌的檢驗(yàn)，GB4789.6-2016《食品安全國(guó) 家 標(biāo) 準(zhǔn) 食 品 微 生 物 學(xué) 檢 驗(yàn) 致 瀉 大 腸 埃希氏菌檢驗(yàn)》要求[6]，生化反應(yīng)符合大腸埃希氏菌特征的菌落需要 進(jìn) 行 PCR 確 認(rèn) 試 驗(yàn);GB4789.12-2016《食品安全國(guó) 家 標(biāo) 準(zhǔn) 食 品 微 生 物 學(xué) 檢 驗(yàn) 肉 毒 梭 菌 及肉毒毒素檢驗(yàn)》要求[7]，對(duì)于肉毒梭菌的檢驗(yàn)，生化反應(yīng)符合肉毒梭菌的菌落需要進(jìn)行毒素基因檢測(cè)，以確定肉毒梭菌具體 類 型;對(duì) 于 大 腸 埃 希 氏 菌 O157：H7/NM 毒力基因 的 測(cè) 定，GB4789.36-2016《食 品 安 全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢 驗(yàn) 大腸埃希氏菌 O157：H7/NM 檢驗(yàn)》中規(guī)定此項(xiàng)檢驗(yàn)屬于選做項(xiàng)目[8];對(duì)于諾如病毒的 檢 測(cè)，GB4789.42-2016《食 品 安 全 國(guó) 家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生 物 學(xué) 檢 驗(yàn) 諾 如 病 毒 檢 驗(yàn)》則 要 求 采 用實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR方法檢測(cè)[9]。

　　2 分子生物學(xué)技術(shù)在檢測(cè)機(jī)構(gòu)食品微生物檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用的技術(shù)制約因素

　　隨著檢驗(yàn)要求的提升和檢驗(yàn)規(guī)模的擴(kuò)大，食品微生物傳統(tǒng)檢測(cè)方法的缺點(diǎn)日益凸顯，如由于不可培養(yǎng)微生物的存在，僅依靠培養(yǎng)手段，在生物多樣性上不能反映微生物的真實(shí)狀況以及檢測(cè)周期長(zhǎng)、檢測(cè)流程復(fù)雜、特異性不足等缺點(diǎn)[11]。盡管存在這些缺點(diǎn)，但是新的技術(shù)并未完全取代原有的技術(shù)，這是因?yàn)樾碌募夹g(shù)也存在各種缺 點(diǎn)。在 一 種 技 術(shù) 的 優(yōu) 越 性 未 得 到 完 全 確 認(rèn)時(shí)，出于對(duì)食品安全的負(fù)責(zé)，監(jiān)管部門不得不繼續(xù)要求檢測(cè)機(jī)構(gòu)采用原有的較為成熟的技術(shù)。制約分子生物學(xué)技術(shù)在食品微生物檢驗(yàn)中應(yīng)用的因素有很多，下面僅對(duì)相關(guān)技術(shù)制約因素進(jìn)行簡(jiǎn)單總結(jié)。

　　2.1 微生物死活的有效區(qū)分與傳統(tǒng)的微生物檢驗(yàn)方法相比，采用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行微生物檢驗(yàn)可實(shí)現(xiàn)對(duì)不可培養(yǎng)微生物的鑒定，在這方面科學(xué)家進(jìn)行了大量的研究并取得了一定的成果[12-13]。這是采用分子生物學(xué)方法進(jìn)行微生物檢驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)之一，但采用此方法進(jìn)行微生物檢驗(yàn)同樣存在不足之處，比如在食品微生物檢驗(yàn)中應(yīng)用最多的分子生物學(xué)技術(shù)是PCR技術(shù)，采用 PCR技術(shù)檢測(cè)食品微生物的主要缺陷是不能區(qū)分微生物的死活，從樣品中提取的微生物即使死掉其 DNA同樣能作為模板進(jìn)行特異性擴(kuò)增，因此在檢測(cè)過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。開(kāi)發(fā)快速、準(zhǔn)確的活菌檢測(cè)技術(shù)是食品微生物檢測(cè)領(lǐng)域的一大挑戰(zhàn)。當(dāng)前國(guó) 內(nèi) 外 一 些 科 學(xué) 家 在 開(kāi) 發(fā) 利 用 PMA/EMA-PCR技術(shù)，根據(jù)他們的文章報(bào)道[14-15]，這項(xiàng)技術(shù)能消除死去的微生物對(duì)PCR擴(kuò)增的影響，使擴(kuò)增信號(hào)只來(lái)源于活的微生物，近年來(lái)這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)開(kāi)始進(jìn)行探索性應(yīng)用，但由于PMA(疊氮溴化丙錠)、EMA(疊氮溴化乙錠)毒性較大，污 染 消 除 也 比 較 困 難，大 規(guī) 模 推 廣 應(yīng) 用 難 度較大。

　　2.2 微生物難以有效富集的缺點(diǎn)如果想利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)食品中的微生物進(jìn)行快速檢測(cè)，菌體的富集分離技術(shù)必不可少。當(dāng)前的菌體富集分離技術(shù)有離心分離技術(shù)、改良增菌培養(yǎng)基富集技術(shù)、膜分離技術(shù)及免疫磁性分離技術(shù)等，但這些方法大都存在一定的缺點(diǎn)。離心分離技術(shù)存在著粘附食品基質(zhì)、大量細(xì)菌損失等缺點(diǎn)[16]。高質(zhì)量的改良增菌培養(yǎng)基的研發(fā)比較困難。采用膜分離技術(shù)時(shí)分離后的菌體常濃縮于食品或?yàn)V膜上，還需要進(jìn)一步洗脫和分離，并且洗脫效果嚴(yán)重影響著細(xì)菌的回收率[17]。使用免疫磁性分離技術(shù)時(shí)，由于食品基質(zhì)復(fù)雜，微生物菌群復(fù)雜多樣，對(duì)于抗體的干擾較大，選擇的抗原靶標(biāo)不特異，將導(dǎo)致 富 集 到 很 多 雜 菌，無(wú) 法 正 確 檢 測(cè) 到 目 標(biāo)菌[18]。同時(shí)免疫磁性分離技術(shù)存在著成本高、需要預(yù)處理、不適合大體積樣品分離等缺點(diǎn)。

　　3 分子生物學(xué)技術(shù)在檢測(cè)機(jī)構(gòu)食品微生物檢測(cè)領(lǐng)域的發(fā)展趨勢(shì)

　　3.1 傳統(tǒng)鑒定技術(shù)與分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合實(shí)際上，現(xiàn)在利用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)基本就是將傳統(tǒng)鑒定技術(shù)與分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合，比如致瀉大腸埃希氏菌、肉毒梭菌的檢驗(yàn)。這些微生物的檢驗(yàn)一般都是先進(jìn)行增菌、生化反應(yīng)鑒定然后再進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，傳統(tǒng)的涂布平板法可以比較準(zhǔn)確地對(duì)微生物數(shù)目進(jìn)行定量，而分子生物學(xué)技術(shù)則可以對(duì)微生物進(jìn)行快速定性，但在定量方面仍然存在不足，這種檢驗(yàn)方法的好處是可以將兩種技術(shù)的優(yōu)勢(shì)結(jié)合起來(lái)，這也是未來(lái)分子生物學(xué)技術(shù)用于食品微生物檢驗(yàn)的發(fā)展趨勢(shì)之一。

　　3.2 進(jìn)一步挖掘現(xiàn)有技術(shù)的潛力如果能將現(xiàn)有技術(shù)的潛力進(jìn)一步發(fā)掘，可能會(huì)產(chǎn)生巨大的應(yīng)用價(jià)值。比如數(shù)字 PCR技術(shù)，這項(xiàng)技術(shù)具有能對(duì)樣品 DNA絕對(duì)定量的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，但當(dāng)前的一個(gè)缺點(diǎn)就是價(jià)格太高，這大大限制了其應(yīng)用。如果隨著科技的進(jìn)步，這項(xiàng)技術(shù)的成本能夠降下來(lái)，那么此項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用范圍會(huì)大大增加。再比如，如果能夠?qū)?PMA 等染料與數(shù)字PCR技術(shù)相結(jié)合，則能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)活菌的絕對(duì)定量。除此之外，微流控芯片、全自動(dòng) PCR 技術(shù)、液相芯片等技術(shù)也已經(jīng)展現(xiàn)出了各自的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[20-22]，需要進(jìn)一步發(fā)掘這些技術(shù)的潛力加以推廣應(yīng)用。

　　3.3 新技術(shù)的開(kāi)發(fā)利用要利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)食品中的微生物進(jìn)行檢測(cè)，一些配套 的 技 術(shù) 也 必 不 可 少，如增菌培養(yǎng)富集技術(shù)、DNA 提取技術(shù)、菌體直接富集分離技術(shù)等，這些技術(shù)與最后的檢測(cè)結(jié)果密切相關(guān)。當(dāng)前這些技術(shù)都有很大的發(fā)展空間，需要科學(xué)家們進(jìn)行進(jìn)一步的研究。如果我們能夠開(kāi)發(fā)出高效率的沒(méi)有前增菌過(guò)程的菌體富集分離技術(shù)，再配套分子生物學(xué)技術(shù)，就可以真正實(shí)現(xiàn)食品微生物的快速檢測(cè)，這在發(fā)生食品安全事件時(shí)顯得特別重要，可以使我們更快地確定病原體。

　　4 展望

　　任何一種技術(shù)都有其缺點(diǎn)，但科學(xué)就是在不斷發(fā)現(xiàn)問(wèn)題與解決問(wèn)題中不斷取得進(jìn)步。分子生物學(xué)技術(shù)作為當(dāng)前生物學(xué)領(lǐng)域發(fā)展最快、應(yīng)用最廣泛的領(lǐng)域，已經(jīng)在食源性病毒如諾如病毒的檢測(cè)中起著不可替代的作用，理應(yīng)也能夠在食品微生物檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)及其他技術(shù)的發(fā)展，食品微生物檢測(cè)技術(shù)必將迎來(lái)廣闊的發(fā)展空間。

　　參考文獻(xiàn)：

　　[1]徐君飛，張居作.2001-2010年中國(guó)食源性疾病暴發(fā)情況分析[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28(27)：313-316.

　　[2]TzschoppeM，MartinA，BeutinL.ArapidprocedureforthedetectionandisolationofenterohaemorrhagicEscherichiacoli(EHEC)serogroupO26，O103，O111，O118，O121，O145andO157strainsandtheaggregativeEHECO104：H4strainfromready-to-eatvegetables[J].IntJFoodMicrobiol，2012，152(1-2)：19-30.

　　[3]張書泰，周斌，童星，等.醬油釀造過(guò)程中微生物多樣性分析方法研究進(jìn)展[J].中國(guó)調(diào)味品，2019，44(2)：193-200.

　　[4]汪冬冬，陳功，李恒，等.二輪鹽漬工業(yè)泡菜微生物群落結(jié)構(gòu)解析[J].中國(guó)調(diào)味品，2019，44(6)：95-100.

　　《分子生物學(xué)技術(shù)在檢測(cè)機(jī)構(gòu)食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用現(xiàn)狀、技術(shù)制約因素與發(fā)展趨勢(shì)》來(lái)源：《中國(guó)調(diào)味品》，作者：丁衛(wèi)平1，楊夕宇2，朱可瀅2，蔡雙鳳2*

轉(zhuǎn)載請(qǐng)注明來(lái)自：http://www.jinnzone.com/shengwuyixuegongchenglw/72109.html