幼齡反芻動物瘤胃微生物的定植過程與調(diào)控措施
在數(shù)百萬年的進化過程中，為適應(yīng)嚴酷的環(huán)境，反芻動物的瘤胃可以在大量攝入飼草料的同時，有效地降解其中的纖維素，瘤胃中的微生物在其中起著關(guān)鍵的作用[1]。反芻動物為微生物群落的建立提供必要的生存環(huán)境，微生物存在于宿主的消化道中，進行微生物發(fā)酵，并從終產(chǎn)物中獲得能量。微生物發(fā)酵過程中的一部分產(chǎn)物可以被宿主利用，因此，瘤胃微生物的 穩(wěn) 定 和 成 熟 在 提 高 反 芻 動 物 的 消 化 代謝、生產(chǎn)性能和機體健康中具有重要作用[2]。
現(xiàn)階段研究發(fā)現(xiàn)，羔羊瘤胃微生物的定植過程大致分為3個階段，出生后0～14d是 外 源 菌 群 引入和作用時期，14～28d是過渡菌群作用階段，28d后瘤胃菌群組成趨于穩(wěn)定[3];同樣，犢牛瘤胃微生物早期定植過程也分為3個階段，且微生物群落在出生后第2和3天發(fā)生顯著變化[4]。此定植過程受多種營養(yǎng)和環(huán)境因素的影響，這也使得對瘤胃微生物的人為調(diào)控成為可能。利用生物技術(shù)手段來控制瘤胃生態(tài)系統(tǒng)，提高反芻動物生產(chǎn)性能已成為反芻動物生產(chǎn)上的主要研究方向。筆者以幼齡反芻動物為對象，綜述了瘤胃微生物的定植過程和主要功能，以期為生產(chǎn)中對幼齡反芻動物的飼養(yǎng)管理、營養(yǎng)調(diào)控提供理論參考。
1 瘤胃的發(fā)育及微生物群落的定植過程
1.1 瘤胃的發(fā)育過程反芻動物的瘤胃在斷奶前類似于非反芻哺乳動物的單胃，在斷奶后逐漸具有反芻功能。反芻動物瘤胃的發(fā)育包括瘤胃重量與容積的增加，瘤胃乳頭的長度和寬度增加、角質(zhì)化程度增加，瘤胃微生物定植等方面。在初生反芻動物哺乳時，瘤胃由于食管溝反射的存在而沒有發(fā)揮功能，此時的瘤胃只占整個消化系統(tǒng)的25%左 右，乳 頭 發(fā) 育 呈 原 始 狀 態(tài);當(dāng)由母乳喂養(yǎng)過渡到粗飼料或精料開食料飼養(yǎng)時，瘤胃容積變大，乳頭快速發(fā)育。成年反芻動物瘤胃占整個消化系 統(tǒng) 的60%～80%[5-6]，成 年 羊 瘤 胃 乳 頭長度約0.5cm，成 年 牛 約1cm[7]。揮 發(fā) 性 脂 肪 酸(VFAs)是瘤胃上皮形態(tài)和功能發(fā)育所必需 的 物質(zhì)，其中，丁酸對瘤胃上皮發(fā)育的刺激最大[8]。宏觀層面上，瘤胃壁吸收丁酸與瘤胃乳頭的生長有關(guān)，如在代乳料中添加丁酸鈉能夠促進瘤胃上皮對 VFAs的吸收利用，增加瘤胃壁乳頭的長度及寬度[9]。在細胞和分子層面，丁酸通過調(diào)控與瘤胃上皮細胞增殖和凋亡相關(guān)的基因表達量使細胞增殖速度高于凋亡 速 度，從而促進瘤胃乳頭生長和細胞層的增厚[10]。在幼齡反芻動物瘤胃發(fā)育早期，食管溝反射使母乳繞過瘤胃直接抵達皺胃，但仍會有少量母乳滴漏進瘤胃，有研究認為，隨母乳進入瘤胃的少量丁酸足以影響 瘤 胃 的 發(fā) 育 和 功 能[11]。隨 著 年 齡 增 長和大量固體飼料的攝入，瘤胃微生物群落的建立影響了瘤胃發(fā)育，改變了瘤胃的結(jié)構(gòu)和生理，瘤胃微生物發(fā)酵碳水化合物使丁酸濃度顯著增加，促進了瘤胃乳頭的發(fā)育和上皮細胞角質(zhì)化程度進程[8]。
1.2 瘤胃微生物的來源反芻動物早期瘤胃微生物有多種來 源，首 先，母體在分娩過程中可以通過產(chǎn)道向初生反芻動物消化道 植 入 有 益 微 生 物，如 纖 維 分 解 菌、產(chǎn) 甲 烷 菌等[6]。Guzman等[12]研究也發(fā)現(xiàn)了上述規(guī)律：在 犢牛出生后20min內(nèi)，在其瘤胃中發(fā)現(xiàn)了典型的功能性微生物群 體，如 產(chǎn) 甲 烷 菌、纖 維 分 解 菌 及 變 形 菌等。其次，目前科學(xué)界認為初生反芻動物對母體的舔舐是其獲取瘤胃菌群的又一主要方式[6]，從初生到2周齡期間，這一方式也被認為是初生反芻動物獲取原蟲的唯一來源[13-15]。再次，反芻動物出生 后會攝取初乳，初乳攜帶母體菌群和發(fā)酵基質(zhì)進入瘤胃，用于 自 身 瘤 胃 菌 群 的 建 立 和 瘤 胃 發(fā) 育[4，6]。除此之外，也有研究認為剛剛出生的幼齡反芻動物瘤胃微生物群可能源于子宮內(nèi)的羊膜，如 Zhang等[3]發(fā)現(xiàn)，剛出生30min內(nèi)的山羊瘤胃內(nèi)存在較高豐度的芽孢桿菌屬和乳酸桿菌屬細菌，而芽孢桿菌在母體羊水中比例很高[16]。同時，反芻動物早期瘤胃內(nèi)微生物與宿主基因存在很強的關(guān)聯(lián)。Weimer等[17]發(fā)現(xiàn)，將瘤胃內(nèi)容物從一頭奶牛轉(zhuǎn)移到另一頭奶牛，受體奶牛的瘤胃 pH 和 VFAs產(chǎn)量在24h內(nèi) 恢 復(fù)到轉(zhuǎn)移前的水平，他猜想這種恢復(fù)可能是由于宿主基因在微生物的建立和維持中起著一定的作用。也有研究發(fā)現(xiàn)，奶牛瘤胃的核心菌群中有一部分成員表現(xiàn)出顯著的可遺傳性，并決定了甲烷的排放量與生產(chǎn)力高低[18]。
1.3 瘤胃微生物的種類瘤胃生態(tài)系統(tǒng)由多種多樣的微生物組成，這些微生物在嚴 格 的 厭 氧 環(huán) 境 中 處 于 共 生 關(guān) 系[19]。瘤胃微生物群由瘤胃細菌、古細菌、原生動物和真菌組成，其濃度分 別 為1010 ～1011、106 ～108、104 ～106、103～106 個細胞/mL[20]。其中，細菌最容易受到瘤胃理化性質(zhì)的影響[21]。此外，還有少量的噬菌體與古噬菌體，作為微生物種群的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子和基因水平轉(zhuǎn)移的推動者而存在[20]。
1.4 反芻動物瘤胃微生物的定植過程隨著研究的深入，科學(xué)家們能夠觀測到的微生物出現(xiàn)在瘤胃的時間越來越早：直接的顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，微生物在出生的第2天附著在瘤胃壁上并在瘤胃 壁 上 定 植[31]。Rey 等[4]利 用 基 于 16SrRNA基因測序發(fā)現(xiàn)，在出生第1天采集的樣本沒有擴增子。也有研究發(fā)現(xiàn)，在 出 生 后1和2d的 犢 牛 瘤 胃液中存在纖維分解菌和變形菌門細菌[32]。Guzman等[12]在出生后20min內(nèi)的犢牛消化道中發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)甲烷菌(M.mobile、M.votae和 Methanobrevibacterspp.)、纖 維 分 解 菌 (F.succinogenes、R.flavefaciens和 P.ruminicola)和 變 形 菌 門 的 土 桿 菌 屬(Geobacterspp.)細菌，表明微生物可能在分娩前或分娩期間已在反芻動物胃腸道內(nèi)存在。
2 瘤胃微生物的功能
腸道菌群局限于腸道局部，無法進入體液乃至遠端不同組織器官，但可以通過作用于腸道產(chǎn)生下游調(diào)控信號，或依賴其代謝產(chǎn)物經(jīng)體液循環(huán)到達遠端組織發(fā)揮調(diào)節(jié)功能。腸道菌群在反芻動物早期的營養(yǎng)代謝中起著重要作用，主要是通過微生物產(chǎn)生的多種酶來完成的。如瘤胃中的芽孢桿菌屬可分泌多種消化酶，包括纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、木聚糖酶等，協(xié)助完成瘤胃中營養(yǎng)物質(zhì)的 消 化 過 程[41]。健 康 的 瘤 胃 微 生 物 群 還具有促進營 養(yǎng) 代 謝、維 持 腸 黏 膜 屏 障、調(diào) 節(jié) 免 疫 系統(tǒng)、抑制病原 菌 感 染 等 多 重 功 能[42]，與 宿 主 健 康 息息相關(guān)。瘤胃 VFAs是 來 源 于 瘤 胃 微 生 物 群 的 重要信號分子，調(diào)節(jié)瘤胃的多種生理功能[43-44]。丁 酸是重要的 VFAs之一，近期研究發(fā)現(xiàn)其對斷奶犢牛有增加體重、生長速度、胸圍、身高、體長等的作用，有利于改善 斷 奶 犢 牛 的 生 長 狀 況[45]。但 不 是 所 有的微生物都有利于宿主健康，反芻動物的大多數(shù)消化系統(tǒng)疾病，如瘤胃膨脹病、急性和亞急性瘤胃酸中毒(subacuteruminalacidosis，SARA)，都與瘤胃微生物群的組 成 和 功 能 紊 亂 有 關(guān)[46]。瘤 胃 內(nèi) 核 心 細菌和真菌屬及其功能見表1。
3 幼齡反芻動物瘤胃微生物的調(diào)控措施
幼齡反芻動物瘤胃微生物是可塑的，而且在很大程度上受 飲 食 的 影 響[52]。反 芻 動 物 在 幼 齡 階 段經(jīng)歷了從非反芻到反芻的生理過渡，反芻階段之前是其最敏感和可塑性最強的時期。在此期間，任何外部環(huán)境或營養(yǎng)的影響都可能導(dǎo)致隨后的短期或長期性變化[53-54]。在幼齡階段對反芻動物瘤胃微生物進行調(diào)控，從而引導(dǎo)菌群的有序定植和健康發(fā)酵機制，改變微生物組的組成及代謝產(chǎn)物，保證機體的健康和后續(xù)生長發(fā)育。目前最常見的幾種瘤胃人工干預(yù)添加劑將在下文介紹，其效果可通過動物表型是否改善來判斷，但其相關(guān)機制仍是今后一段時間的研究重點。
3.1 益生菌與益生元益生菌指活的、對胃腸道(gastrointestinaltract，GIT)有益的微生物，廣泛使用的益生菌包括乳酸桿菌(Lactobacillus)、雙歧桿菌(Bifidobacterium)、酵 母菌(Saccharomyces)等[55]。飼糧中添加益生菌能夠增加反芻動物腸道中有益微生物的數(shù)量，并減少腸道中有害微生物的數(shù)量。有研究表明，由復(fù)合益生菌組成的添 加 劑 能 夠 有 效 減 少 犢 牛 腹 瀉 的 持 續(xù) 時間[56]。補充益生菌飼料也對薩能奶山羊的采食量、泌乳性能和 腸 道 健 康 產(chǎn) 生 積 極 影 響[57]。已 知 的 益生菌主要調(diào) 控 機 制 包 括：①調(diào) 控 微 生 態(tài)，促 進 GIT有益功能微生物的生長和定植[58];②提高營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收[59];③產(chǎn) 生 更 多 的 抗 菌 類 物 質(zhì)，包 括細菌素和 VFAs等[60-61];④誘導(dǎo)相關(guān)致病菌的基因表達[62];⑤ 調(diào) 節(jié) 機 體 的 腸 道 和 體 液 免 疫 功 能[63]; ⑥抵抗有害菌及病原菌在腸黏膜的定植[64]。益生元是被宿主微生物選擇性地利用以起積極作用的底物，向幼畜飼糧中添加益生元有利于其早期的生長發(fā)育。如在犢牛飼糧中添加活酵母培養(yǎng)物可以提高犢牛活重與飼料效率，并可能對免疫有積極的影響[65]。
3.2 植物提取物植物自身會合成一些有機化合物，發(fā)揮驅(qū)趕昆蟲和防止微生物感染等作用。植物提取物即為通過一些人工萃取手段得到的這些有機化合物，包括皂苷、單寧、牛至精油等。其中精油是研究最多、最有利用價值的植物提取物。精油是從芳香植物中提取的具有揮發(fā)性、有強烈氣味的復(fù)雜化合物，在反芻動物中使用精油飼料添加劑，有提高生產(chǎn)性能、降低甲烷和氨氣排放等作用[66]。相關(guān) meta分析結(jié)果表明，向哺乳期奶牛補充混合精油(每頭奶牛1g/d)能夠增加奶牛產(chǎn)奶量(4%)和減少甲烷排放(-10%)[67]。對于幼齡反芻動物，精油添加劑能夠在不改變干物質(zhì)采食量和飼料轉(zhuǎn)化率的情況下增加日增重，可作為幼齡反芻 動 物 的 生 長 促 進 劑[68]。一 些 精 油 可 以通過直接抑制某些促成甲烷生成的微生物的代謝過程來直接抑制甲烷生成，如百里香、牛至、肉桂等的提取物。精油減少氨氣排放也是通過抑制與蛋白質(zhì)水解有關(guān)的微生物以減少蛋白質(zhì)在瘤胃中的降解，增加過瘤胃蛋白實現(xiàn)的。但使用精油作為飼料添加劑會降低飼料消化率，影響動物養(yǎng)分的吸收[69-70]，這也是營養(yǎng) 學(xué) 家 將 其 歸 為 抗 營 養(yǎng) 因 子 的 原 因。Lei等[71]通過在山 羊 飲 食 中 添 加 牛 至 精 油 和 鈷 的 復(fù) 合物發(fā)現(xiàn)，添加牛至精油能夠有效改善山羊的絨品質(zhì)和肉品 質(zhì)，并改善山羊的瘤胃發(fā)酵參數(shù)，提 高 瘤 胃Bacteroidesspp.和Succinivibriosp.的 相 對 豐 度，促進瘤胃丁酸的產(chǎn)生，同時指出牛至精油發(fā)揮作用相對應(yīng)的基因通路，重要的基因類別分布在碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝和異生素生物降解通路。這些結(jié)果表明，補喂精油組的微生物群可能具有更高的氮利用 能 力 和 更 高 的 異 生 物 質(zhì) 生 物 降 解 和 代 謝 能力[72]。綜合前期相關(guān)研究，牛至精油的生物學(xué)作用主要包括以下幾個方面：①保持全混合飼糧(TMR)營養(yǎng)品質(zhì)，滅減飼糧次生霉菌、酵母菌、大腸桿菌;減少次生發(fā)酵毒素產(chǎn)生;減少飼糧次生發(fā)酵營養(yǎng)損失;改善 TMR 飼 糧 適 口 性;②提 高 TMR 飼 糧 飼 喂 效率，滅減瘤胃有害微生物;③提高牛羊瘤胃及消化道健康水平，減 少 病 原 微 生 物 定 殖 機 會、增 強 免 疫 機能;④提高牛羊生產(chǎn)性能，提高繁殖效率、生長性能、泌乳性能。
3.3 抗菌肽近 年 來，抗 菌 肽 (antimicrobial peptides，AMPs)由于能夠破壞細菌和其他病原體的膜完整性而成為抗生素的替代物之一[73]。據(jù)報道，飼料中添加 AMPs可以增加山羊瘤胃纖維桿菌屬，厭氧弧菌屬(Anaerovibrio)和 頭 毛 蟲 屬(Ophryoscolex)的豐富度，同時降低普雷沃氏菌科(Paraprevotellaceae)CF231、琥 珀 酸 弧 菌 屬 (Succinivibrio)和 均 毛 蟲 屬(Isotricha)的豐富度，使山羊瘤胃微生物群結(jié)構(gòu)得到改善，瘤胃發(fā)酵過程發(fā)生改變，飼料利用效率提高，因此認為 AMPs適合作為幼齡山羊的飼料添加劑[74]。
3.4 有機酸pH 是維持瘤胃功能的重要因素之一，綿 羊 正常瘤胃 pH 在6.4～6.8之 間[75]，奶 牛 瘤 胃 pH 在1d之內(nèi)的變化范圍為5.8～6.1[76]，由于幼齡反芻動物消化系 統(tǒng) 尚 未 發(fā) 育 完 善，胃 酸 分 泌 不 足，瘤 胃pH 易處于異 常 范 圍，因 此 需 依 靠 外 源 酸 化 劑 來 維持平衡。有機酸即為常用的一類酸化劑，包括乳酸、丙酸、乙酸等。乳酸、乙酸等有機酸可以抑制病原菌的生長，提飼料利用率，谷物中添加有機酸可增加奶山羊瘤胃抗性淀粉含量，降低瘤胃酸中毒的風(fēng)險，同時能 減 輕 炎 癥 反 應(yīng)[77]。在 奶 牛 的 TMR 中 添 加 有機酸能增加3.5%乳 脂 校 正 乳 和 乳 蛋 白 含 量，還 能用于長期維持奶牛飼糧溫度的穩(wěn)定[78]。
3.5 酶制劑反芻動物常用的酶制劑有淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶、β-葡聚糖 酶、果 膠 酶 及 復(fù) 合 酶 等，可 提 高 飼 料消化率、調(diào)節(jié)動物腸道健康等[79]。酶制劑可直接添加于飼料中使用，如以α-淀粉酶為主要成分的酶制劑(amilosubtilineHClenzyme)添加在奶 牛 飼 料 中效果顯著;酶制劑能與其他飼料添加劑協(xié)同作用，使奶牛 產(chǎn) 奶 量 提 高 9.9%，同 時 牛 奶 的 質(zhì) 量 也 提 高了[80];酶制劑也可用于飼料調(diào) 制，以 提 高 飼 料 營 養(yǎng)價值，如利用纖維素酶和木聚糖酶處理的橄欖餅飼喂羔羊，可提高羔羊的采食量和消化率，增加羔羊的日增重[81]。
4 小結(jié)與展望
深入、精準、標準化研究瘤胃微生物的作用機制是目前應(yīng)對全球高質(zhì)量動物蛋白的需求和挑戰(zhàn)的重大課題。現(xiàn)階段對于瘤胃微生物的建立及其對瘤胃發(fā)展的重要性的了解仍然非常局限，主要面臨的技術(shù)問題是瘤胃微生物的體外可培養(yǎng)化。筆者認為今后研究的重點應(yīng)該聚焦于以下幾個方面：①瘤胃微生物培養(yǎng)組學(xué)的成熟運用，構(gòu)建可用于深入研究瘤胃菌株功能的瘤胃微生物菌株庫，反芻動物微生物研究應(yīng)實現(xiàn)多學(xué)科的交融和合作，大尺度進行瘤胃微生物的可培養(yǎng)化研究;②精準把握不同反芻動物的早期干預(yù)時間，瘤胃微生物的高效作用取決于生命早期的人工干預(yù)，具體干預(yù)的時間節(jié)點一直是科學(xué)界爭議的話題;③幼齡反芻動物的研究重點應(yīng)聚焦瘤胃，但應(yīng)結(jié)合后消化道的微生物研究，后腸微生物對于腸道免疫的激發(fā)至關(guān)重要;④結(jié)合宏基因組學(xué)、宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)和蛋白組學(xué)等技術(shù)，系統(tǒng)全面地研究瘤胃與宿主互作的機制，精準尋求靶向功能微生物、靶向代謝產(chǎn)物及靶向蛋白，為人工干預(yù)給予理論支持。
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《幼齡反芻動物瘤胃微生物的定植過程與調(diào)控措施》來源：《中國畜牧獸醫(yī)》，作者：郭 旭，張 科，陳玉林，楊雨鑫*
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