摘要：紅曲霉能代謝生成天然紅色素和多種生理活性物質(zhì)而備受人們關注，但同時也發(fā)現(xiàn)其生長過程產(chǎn)生桔霉素。桔霉素是一種真菌毒素，具有腎臟毒性，可以引起實驗動物的腎臟腫大、尿量增多、腎小管擴張和上皮細胞變性壞死等癥狀。紅曲霉中桔霉素的發(fā)現(xiàn)使得我國的紅曲產(chǎn)品的安全性引起爭議。本文對紅曲霉中桔霉素的產(chǎn)生、理化特性和檢測方法等內(nèi)容進行綜述。

　　關鍵詞：桔霉素，紅曲霉

　　紅曲作為一種微生物發(fā)酵食品，在中國及其他亞洲國家已有數(shù)百年的應用歷史。將紅曲提取色素添加于肉制品、魚制品、豆制品等各種食品中的主要目的，是賦予產(chǎn)品美觀的色澤，如中國的叉燒肉、燒烤肉、醬鹵肉、肉丸、各式灌腸或臘腸等。日本、印尼等國的一些肉制品中也應用了紅曲色素，應用的主要目的是紅曲色素的添加使產(chǎn)品呈現(xiàn)美觀、均質(zhì)、持久的紅色澤，同時也作為調(diào)味料和防腐料，在一定程度上可提鮮增香和抑菌防腐。在中國傳統(tǒng)醫(yī)學上就將其作為防病保健食品，具有特殊的藥理及營養(yǎng)功效，近代對其研究的深入，使得一些以紅曲米為原料制備的中藥制劑問世，例如作為降膽固醇、降血脂、降高血壓、抗菌消炎、抗腫瘤等藥劑。在特別看重“純天然”食品的歐洲，作為天然添加劑的紅曲色素早已引起廣泛關注。

　　從1998年開始，由于歐洲科學家發(fā)現(xiàn)紅曲中存在著一種名為桔霉素的物質(zhì)對人體有潛在危害，使我國紅曲出口受到嚴重威脅。目前，德國及歐美各國已在制訂針對我國出口的紅曲及相關產(chǎn)品的新標準，嚴格限制紅曲及相關產(chǎn)品中桔霉素的含量，必須低于規(guī)定值，否則將禁止進口及銷售。而目前我國的紅曲及其相關產(chǎn)品中桔霉素含量很難達到控制標準，桔霉素問題成為限制我國紅曲及相關產(chǎn)品出口的瓶頸問題。在這種情況下，如何減少紅曲中的桔霉素含量是一個迫切需要解決的問題。本文綜述了紅曲中桔霉素的產(chǎn)生、理化特性和檢測方法，并提出了控制桔霉素的具體措施。

　　1桔霉素的產(chǎn)生

　　1.1桔霉素的各種產(chǎn)生菌

　　桔霉素(citrinin)是由真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物。自然界中許多青霉和曲霉菌株能產(chǎn)生桔霉素，青霉中有糾纏青霉、瘦青霉、詹森青霉、黃綠青霉、擴展青霉、點青霉等;曲霉中有土曲霉、雪白曲霉、白曲霉、紅曲霉等。產(chǎn)桔霉素的特征菌是桔青霉(Pencilliumcitrinium)。據(jù)報道，用查氏葡萄糖培養(yǎng)液30L接種桔青霉，培養(yǎng)兩周后可提取桔霉素45~60g，產(chǎn)量高達1500~2000mg/L[1]。

　　1.2紅曲霉中桔霉素的產(chǎn)生

　　對紅曲霉及其代謝產(chǎn)物產(chǎn)生桔霉素的研究開始于90年代。1981年，香港中文大學的HinchungWang等人首次分離出紅曲中的一種抑菌因子，命名為monascidinA。1993年，法國Blanc教授領導的研究小組用質(zhì)譜、核磁共振和紫外及熒光分析等多種方法對monascidinA進行了結(jié)構(gòu)測定，定性分析，發(fā)現(xiàn)monascidinA實質(zhì)是桔霉素。此后，日本、美國、荷蘭先后開展了研究[2]。

　　青霉和曲霉產(chǎn)桔霉素是經(jīng)一個乙酰CoA分子和三個丙二酰CoA分子縮合成丁酮，然后進一步轉(zhuǎn)化成桔霉素。而在紅曲霉培養(yǎng)時，首先由一個乙酰CoA分子和四個丙二酰CoA分子縮合成戊酮，然后分經(jīng)兩條途徑：一條途徑是此戊酮再與丙二酰CoA分子縮合成己酮，最后生成紅曲色素;另一途徑是此戊酮經(jīng)甲基化、縮合、還原、烷基化、還原、氧化、脫水等步驟，最后生成桔霉素[3]。如下圖所示：

　　乙酰CoA+丙二酰CoA

　　聚酮酶

　　(B)四酮化合物(A)

　　五酮化合物

　　中間產(chǎn)物

　　桔霉素

　　CoASH

　　CO2

　　曲霉屬或

　　青霉屬

　　六酮化合物

　　紅曲色素

　　(B)

　　圖1紅曲色素、桔霉素產(chǎn)生過程

　　2桔霉素的理化特性

　　從桔青霉(Penicilliumcitrinium)的蔡氏培養(yǎng)液中分離的桔霉素為檸檬一黃色針狀棱形結(jié)晶，酸性。熔點：173~174℃。溶解性：純桔霉素很難溶于水，溶于氯仿、丙酮、乙酸乙酯、乙醇，微溶于乙醚。桔霉素的鈉鹽易溶于水。呈色反應：桔霉素與三氯化鐵、溴、高錳酸鉀反應呈陽性。溶于95%乙醇呈黃色，加過氧化氫后褪色，然后變淺褐，再加0.1mol/L硫酸變?yōu)槌赛S色，再加0.2mol/L氫氧化鈉又恢復酒紅色[4]。桔霉素：(3R,4S)-4,6-二氫-8-羥基-3,4,5-三甲基-6-氧-3H-2-苯砒-7-羧酸，IUPAC：(3R，4S)-4，6-dihydro-8-hydroxy3，4，5-trimethyl-6-oxo-3H-2-benzopyran-7-carboxylicacid。桔霉素的2種異構(gòu)體如下圖：

　　圖2桔霉素的2種異構(gòu)體

　　3桔霉素毒性

　　桔霉素是一種真菌毒素(mycotoxin)，具有腎毒性，也稱為腎毒素(nephrotoxin)，毒性比較明顯，可引起實驗動物的腎臟腫大、尿量增多、腎小管擴張和上皮細胞變性壞死等癥狀。經(jīng)口喂，小鼠半致死量為110mg/kg[5]。在對小鼠的實驗中，桔霉素減少了腎皮質(zhì)和肝細胞中線粒體磷酸化的效率，顯著抑制了腎皮質(zhì)和肝細胞中2-酮戊二酸和丙酮酸脫氫酶的活性，使線粒體膜內(nèi)外電位差減小，和呼吸鏈有關的幾種酶系，蘋果酸和谷氨酸的脫氫酶的活性受到抑制，桔霉素使線粒體基質(zhì)中Ca2+的水平明顯減少，影響膜轉(zhuǎn)移和氧化還原系統(tǒng)。在對BHK-21細胞的實驗中發(fā)現(xiàn)，桔霉素阻止了約45%的氧的消耗;約86%的葡萄糖不被利用。用與桔霉素結(jié)構(gòu)類似物毛地黃普素處理的細胞，在ADP存在下以琥珀酸代謝供能時，其呼吸速率也被減少了約39%。用桔霉素處理過的細胞產(chǎn)生了很少的丙酮酸，但不能產(chǎn)生乳酸。桔霉素影響了呼吸鏈中能量的產(chǎn)生和糖酵解中乳酸的產(chǎn)生。在暴露于桔霉素l0h后，對細胞進行電鏡檢查，發(fā)現(xiàn)線粒體發(fā)生劇烈變化，腫大并引起細胞死亡[6]。

　　桔霉素同時有致畸性。據(jù)Ciegler等[4]的研究報告顯示，在給發(fā)育4d的雞胚胎注射桔霉素后，胚胎中的腳發(fā)生了變形。LD50值為80.5μg/egg，最大值131μg/egg，最小值54.3μg/egg。注射10μg/egg的致畸率為6%，50μg/egg的為46%，100μg/egg的為48%，150μg/egg的為73%。

　　4桔霉素的檢測方法

　　4.1薄板層析法

　　薄板層析法是常用的定性和半定量確定紅曲終得桔霉素含量的方法，方法靈敏簡單，分為單項層析和雙向?qū)游�。胡曉清等[8]利用水溶性色素和脂溶性色素在不同溶劑中溶解性的差異，以酸性水溶液為提取劑，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸(6∶3∶1)為展開劑，桔霉素的分離效果良好，排除了絕大部分色素的干擾。由于紅曲中色素的含量很高，并且紅曲的色素有6~8種之多，不同來源的紅曲，其色素中紅、橙、黃色素的量也不同。固態(tài)發(fā)酵得到的產(chǎn)物中還含有含量大量的其他代謝產(chǎn)物。所有這些都會對檢測帶來影響。用一般的薄層層析法分析紅曲中的桔霉素，因干擾物太多，很難在板上分辨出來。因此宜采用雙向薄層層析法。宮慧梅等[7]采用雙向展開劑檢測桔霉素利用雙向薄層層析法可檢測紅曲中的桔霉素。這種方法可用于生產(chǎn)企業(yè)的自我監(jiān)控方法簡單易行，容易掌握所需的物品也不復雜，其最小檢測量為0.1μg，是現(xiàn)階段桔霉素檢測的一種非常實用的方法。但不能進行定量分析，存在的干擾因素較多[8]。

　　4.2酶聯(lián)免疫法

　　酶聯(lián)免疫法是利用抗原和抗體的免疫反應和酶的催化反應相結(jié)合而建立的一種新方法。Abramson等利用傳統(tǒng)抗血清完成對citrinin的酶聯(lián)免疫法，但其精確度仍有待改善。因為Abramson生產(chǎn)的是傳統(tǒng)多元性抗體，而紅曲菌中有許多citrinin構(gòu)型大小類似的分子可能會有相當?shù)慕徊娣磻�，而造成誤判[9、10]。陳富生等制備了牛血清白蛋白一一桔霉素包被抗原，用卵蛋白一一桔霉素連接物免疫小白鼠，得到抗血清，采用ELISA測定了小鼠抗血清效價，建立競爭ELISA檢測紅曲中桔霉素的方法[11，12]。

　　4.3高效液相色譜法

　　高壓液相色譜法最精確，最近還發(fā)展了反相高效液相色譜法，配合熒光檢測儀;采用冷凍干燥處理細胞，加入有機溶劑提取，所得結(jié)果比較精確靈敏。但是，樣品的前處理仍然很麻煩，提取中桔霉素的損失也較多[13]。

　　紅曲中化學成分非常多，目前鑒定出來的已有幾十種，桔霉素僅是其中一種。要想通過高效液相色譜準確測定出紅曲色素中桔霉素的含量，最重要的是要將桔霉素與紅曲色素中其他成分分離開來，在實驗中發(fā)現(xiàn)分離用的液相色譜柱對桔霉素的分離效果影響很大，用于分離測定紅曲中桔霉素含量時，以瑞典產(chǎn)的Krorrnsi1Cl8分離效果最好。除色譜柱對分離效果影響較大外，選擇合適的流動相將直接影響著桔霉素的分離效果。從操作簡便且分離效果好等力一面綜合考慮，通過比較不同的流動相，最后選定冰醋酸水溶液和甲醇(20%水醋酸水:甲醇==70:30)作流動相時獲得了較理想的分離效果[14]。柴秋兒等[15]研究結(jié)果表明，ADS-5樹脂可以純化桔霉素，而且能好地減少色素的影響，經(jīng)熒光檢測器檢測檢出桔霉素含量最低檢出限為0.2μg/L。該方法穩(wěn)定可靠，為紅曲產(chǎn)品的質(zhì)量、安全使用及國際市場的開拓提供支持。

　　4.4抑菌圈法

　　抑菌圈法比較直接，利用紅曲中所含桔霉素的抗菌性來間接定性和半定量。利用紅曲中所含桔霉素的抗菌性來間接定性和半定量。根據(jù)經(jīng)驗，紅曲中存在其他的抑菌物質(zhì)，所以用此法檢測紅曲樣品誤差較大，并且不同的樣品抑菌物質(zhì)的含量都有變化[1]。

　　5結(jié)束語

　　紅曲是我國傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品，毒理學實驗已證明了紅曲產(chǎn)品的食用安全性，并在長期的應用實踐中未發(fā)現(xiàn)明顯的毒副作用，但我國紅曲的生產(chǎn)和應用行業(yè)都在密切關注桔霉素問題。近年來，我國紅曲產(chǎn)品的出口已開始受到國際市場的壓力，據(jù)悉，紅曲產(chǎn)品已受到日本衛(wèi)生部門的嚴格檢驗，認定為不含桔霉素才允許生產(chǎn)和出口，德國也明確提出今后若從中國進口紅曲，必須有安全生產(chǎn)菌種及產(chǎn)品不含桔霉素的證明。紅曲產(chǎn)品作為食品添加劑，應當不含桔霉素或盡可能少含桔霉素，所以可從以下幾點考慮：首先應當篩選不產(chǎn)桔霉素或桔霉素生成量很低的菌種用于生產(chǎn)關于菌種問題。其次是通過發(fā)酵工藝的改良，減少桔霉素的生成關于培養(yǎng)基[13、16]。桔霉素因其攜帶一個酸性基團，所以需供氧率較色素高。因此可以通過調(diào)控培養(yǎng)過程中的通風和攪拌，控制桔霉素的合成[17]。因此，篩選低產(chǎn)或不產(chǎn)桔霉素的紅曲霉菌種，對于我國紅曲及其產(chǎn)品的生產(chǎn)和應用都將具有特別重要的意義。

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