微衛(wèi)星DNA又稱簡(jiǎn)單重復(fù)序列（Simplesequencerepeat，SSR），是基因組中由1～6個(gè)核苷酸組成的基本單位重復(fù)構(gòu)成的一段DNA序列。與其他分子標(biāo)記相比，微衛(wèi)星DNA多態(tài)性高、數(shù)量豐富并重復(fù)性好，而且具有遺傳共顯性、對(duì)基因組有很好的覆蓋性和操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)[1-3]。

　　摘要：從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得47913條茶樹(shù)（Camelliasinensis）EST序列，通過(guò)Cd-hit-est除去冗余序列后得到26185條非冗余序列，利用Misa軟件分析后共發(fā)現(xiàn)8244個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分布于6283條EST序列中，平均相隔1.52kb出現(xiàn)1個(gè)SSR，EST-SSR序列出現(xiàn)頻率為23.99%。其中，單、二和三核苷酸重復(fù)為主導(dǎo)類型，占EST-SSR總數(shù)的97.83%。A/T、AG/CT和AAG/CTT作為單、二和三核苷酸的優(yōu)勢(shì)重復(fù)基元，分別占所屬類型的92.99%、85.11%和26.99%。利用Primer5.0軟件，設(shè)計(jì)了76對(duì)引物進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中59對(duì)引物可以擴(kuò)增出明顯的條帶，34對(duì)引物具有多態(tài)性，多態(tài)性比率高達(dá)57.63%，表明茶樹(shù)EST-SSR中的多態(tài)性位點(diǎn)比較豐富，比較適合進(jìn)行大規(guī)模的EST-SSR多態(tài)性標(biāo)記的篩選。

　　關(guān)鍵詞：茶樹(shù)（Camelliasinensis）,EST-SSR,分布特征

　　根據(jù)SSR標(biāo)記來(lái)源的序列性質(zhì)不同，SSR標(biāo)記可分為基因組SSR（GenomicSSR，gSSR）和表達(dá)序列標(biāo)簽SSR（ExpressedsequencetagSSR，EST-SSR）兩種。gSSR標(biāo)記是來(lái)源于整個(gè)基因組的，而EST-SSR標(biāo)記則來(lái)源于基因組的轉(zhuǎn)錄區(qū)域即表達(dá)區(qū)，可以直接反映功能基因的多態(tài)性，為功能基因的直接鑒定提供了可能性，具有通用性更高的優(yōu)點(diǎn)[4]。我國(guó)是茶樹(shù)（Camelliasinensis）的原產(chǎn)地，茶樹(shù)也是我國(guó)目前非常重要的經(jīng)濟(jì)作物。截至2013年5月，在GeneBank中可獲得47913條茶樹(shù)EST序列，相比2010年5月時(shí)，增加了3倍[5]�；�于茶樹(shù)EST序列信息的快速擴(kuò)增，本研究對(duì)已有的茶樹(shù)EST序列中SSR信息進(jìn)行了全面的發(fā)掘，對(duì)其組成、特征及分布進(jìn)行了分析，同時(shí)設(shè)計(jì)了76對(duì)EST-SSR引物，并對(duì)19份茶樹(shù)樣品材料進(jìn)行了多態(tài)性分析，從而開(kāi)發(fā)了可以用于茶樹(shù)的EST-SSR標(biāo)記，為開(kāi)發(fā)新的茶樹(shù)功能基因組SSR標(biāo)記提供了理論依據(jù)，為建立茶樹(shù)EST-SSR標(biāo)記和探索其在功能基因發(fā)掘、種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性分析中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

　　1材料與方法

　　1.1EST序列的獲得

　　1.2EST-SSR的搜索與預(yù)處理

　　1.3EST-SSR引物的設(shè)計(jì)與合成

　　1.4基因組DNA提取與PCR擴(kuò)增

　　試驗(yàn)中所用的19份茶樹(shù)樣品材料來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所和湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)與茶葉研究所。采用天根生化科技（北京）有限公司植物基因組DNA提取試劑盒提取每個(gè)樣品材料的基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其基因組DNA質(zhì)量，-20℃下保存?zhèn)溆�。PCR反應(yīng)體系為15μL，包括2×PCRMasterMix7.5μL，10μmol/L上、下游引物各0.6μL，基因組DNA1.0μL，ddH2O補(bǔ)至15μL。PCR反應(yīng)在Bio-RadS-1000TMPCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，最適退火溫度退火30s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min，結(jié)束后將產(chǎn)物置于4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)其多態(tài)性，250V電泳2.5h，電泳結(jié)束后銀染顯色，并記錄。

　　2結(jié)果與分析

　　2.1EST-SSR分布頻率及特點(diǎn)

　　47913條茶樹(shù)EST序列經(jīng)拼接處理后共獲得26185條無(wú)冗余、高質(zhì)量的EST序列。運(yùn)用Misa軟件對(duì)26185條共12552726bp的非冗余EST序列進(jìn)行SSR搜索得到6283條微衛(wèi)星序列，占EST總數(shù)的23.99%。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，1～6個(gè)堿基的排列組合重復(fù)均能被檢出，但各種類型的EST-SSR出現(xiàn)的頻率數(shù)量大不相同，共有4153個(gè)單核苷酸型SSR、2935個(gè)二核苷酸型SSR、977個(gè)三核苷酸型SSR、76個(gè)四核苷酸型SSR、41個(gè)五核苷酸型SSR及62個(gè)六核苷酸型SSR。

　　如圖1所示，從微衛(wèi)星數(shù)目的角度分析，以單核苷酸重復(fù)的數(shù)目最多，占50.38%；其次是二核苷酸重復(fù)和三核苷酸重復(fù)，分別占35.60%和11.85%；五核苷酸重復(fù)所占比例最低（0.50%）。單、二和三核苷酸為主要重復(fù)類型，占EST-SSR總數(shù)的97.83%，基元長(zhǎng)度大于或等于4的核苷酸重復(fù)所占的比例極小，僅為2.17%。

　　2.2EST-SSR基元類型和比例

　　從圖2可以看出，單核苷酸重復(fù)類型中，A/T重復(fù)頻率最高，占單核苷酸重復(fù)數(shù)目的92.99%；二核苷酸重復(fù)類型中AG/CT重復(fù)數(shù)目最多（2498個(gè)），占二核苷酸重復(fù)數(shù)目的85.11%，AC/GT和AT/AT重復(fù)頻率相當(dāng)，沒(méi)有出現(xiàn)GC/GC重復(fù)類型；三核苷酸重復(fù)10種類型中，AAG/CTT重復(fù)頻率最高（26.99%），其次分別是ACC/CTG（21.29%）、ATC/ATG（13.20%），其他7種基元的頻率均不高于10%；四核苷酸重復(fù)類型發(fā)現(xiàn)了14種，除AAAC/GTTT（14.47%）、AAAG/CTTT（23.68%）和AAAT/ATTT（13.16%）外，其他類型重復(fù)出現(xiàn)的頻率均較低，重復(fù)數(shù)目低于10個(gè)；五、六核苷酸重復(fù)數(shù)目分別有41個(gè)和62個(gè)，但是出現(xiàn)次數(shù)都很少，均為個(gè)位數(shù)。2.3茶樹(shù)EST-SSR引物的多態(tài)性分析

　　利用Primer5.0軟件，在26185條EST序列中隨機(jī)選取了其中含有SSR位點(diǎn)的序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，共設(shè)計(jì)了76對(duì)EST-SSR引物。利用這76對(duì)EST-SSR引物對(duì)19份茶樹(shù)樣品進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中59對(duì)引物能夠擴(kuò)增出較清晰的條帶，其余17對(duì)引物無(wú)明顯條帶，即未能擴(kuò)增出產(chǎn)物。在可擴(kuò)增出的較清晰條帶引物中，42對(duì)引物的擴(kuò)增條帶大小與預(yù)期片段大小相近，另外17對(duì)引物擴(kuò)增條帶大小明顯與預(yù)期不符。其中，34對(duì)引物能夠擴(kuò)增出多態(tài)性條帶，多態(tài)性引物占擴(kuò)增引物的57.63%，占所有設(shè)計(jì)引物的44.74%。圖3為引物A41、A58在19份茶樹(shù)樣品中的擴(kuò)增結(jié)果，把這兩個(gè)引物結(jié)合起來(lái)足以有效區(qū)分19份茶樹(shù)樣品。

　　3小結(jié)與討論

　　本研究對(duì)47913條茶樹(shù)EST序列進(jìn)行了EST-SSR特征分析。結(jié)果表明，茶樹(shù)EST序列中分布的微衛(wèi)星序列相當(dāng)豐富，含不同重復(fù)基元SSR的EST序列有6283條，約占EST序列的13.11%，該篩出率高于已報(bào)道的高梁（SorqhumbicolorL.Moench）（3.6%）、大麥（Hordeumvulgare）（3.4%）和小麥（TriticumaestivumLinn.）（3.2%），表明茶樹(shù)EST-SSR標(biāo)記具有一定的開(kāi)發(fā)潛力。其中共8244個(gè)EST-SSR序列，平均相隔1.52kb出現(xiàn)1個(gè)SSR，出現(xiàn)頻率明顯高于小麥[7]（1/15.6kb）、柑橘（CitrusreticulataBlanco）[8]（1/5.7kb）、大麥[9]（1/6.3kb）和楊樹(shù)（PopulusL.）（1/14.0kb）[10]等植物，這表明茶樹(shù)轉(zhuǎn)錄組中SSR數(shù)量很豐富，這種差異可能與搜索SSR的算法（如參數(shù)設(shè)定）等多種因素有關(guān)。

　　當(dāng)4種不同的堿基隨機(jī)組合時(shí)，將可能分別產(chǎn)生2、4、10、33、102和350種單、二、三、四、五、六核苷酸重復(fù)[11]。本研究中單核苷酸的2種重復(fù)和三核苷酸的10種重復(fù)均有出現(xiàn)，二核苷酸重復(fù)中僅缺乏GC/GC重復(fù)類型，但大多數(shù)四、五和六核苷酸重復(fù)均未出現(xiàn)，表現(xiàn)出明顯的偏倚性，且每一種重復(fù)類型所占比例也各不相同。單核苷酸重復(fù)是主導(dǎo)類型，其次是二核苷酸和三核苷酸。單核苷酸中A/T出現(xiàn)頻率最高，是所有單核苷酸重復(fù)類型的92.99%。在二核苷酸重復(fù)類型中所占比列最重的是AG/CT，是所有二核苷酸重復(fù)類型的85.11%，沒(méi)有出現(xiàn)CG/CG重復(fù)。三核苷酸類型中，AAG/CTT、ACC/CTG和ATC/ATG等排列組合出現(xiàn)頻率比較高，依次所占比列為26.99%、21.29%和13.20%。這與金基強(qiáng)等[5]報(bào)道的茶樹(shù)EST-SSR中的優(yōu)勢(shì)重復(fù)類型是一致的。

　　本研究利用EST序列共設(shè)計(jì)了76對(duì)EST-SSR引物，并對(duì)19份茶樹(shù)樣品進(jìn)行了檢測(cè)分析，共篩選出具有多態(tài)性的SSR引物34對(duì)，多態(tài)性引物比例為44.74%。有17對(duì)引物不能進(jìn)行有效擴(kuò)增，其原因可能是由于擴(kuò)增區(qū)段存在較為復(fù)雜高級(jí)結(jié)構(gòu)或者是上、下游引物含有內(nèi)含子。綜上所述，茶樹(shù)EST-SSR基元重復(fù)類型豐富，多態(tài)性位點(diǎn)也較豐富，因此，獲得的SSR標(biāo)記具有較高的可用性，對(duì)于豐富其分子標(biāo)記類型及數(shù)量、建立遺傳圖譜及進(jìn)行比較基因組研究都有重要意義。

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