摘要：為了改變傳統(tǒng)的將兩棲類動(dòng)物處死后再?gòu)募∪馓崛�DNA的取樣方法，采用非傷害性取樣方法分別采集了虎紋蛙的血液和趾提取DNA，并與從其肌肉中提取的DNA進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示：使用血液和趾提取的DNA產(chǎn)量與肌肉樣本的DNA產(chǎn)量相當(dāng)；隨后，分別對(duì)3種方法取樣的樣本進(jìn)行了線粒體16SrRNA和核DNA的微衛(wèi)星PCR分析，結(jié)果表明：3種取樣方法所獲得的擴(kuò)增效果相當(dāng)，均能滿足虎紋蛙的保護(hù)遺傳學(xué)研究．因此認(rèn)為，用非傷害性取樣技術(shù)替代傳統(tǒng)的肌肉取樣的方法在無尾兩棲類的保護(hù)遺傳學(xué)研究中是切實(shí)可行的。

　　關(guān)鍵詞：非傷害性取樣,無尾兩棲類,保護(hù)遺傳學(xué),聚合酶鏈反應(yīng)

　　保護(hù)遺傳學(xué)與分子生態(tài)學(xué)的研究已經(jīng)成為現(xiàn)代生物學(xué)研究的熱點(diǎn)，作為研究基礎(chǔ)的DNA，其質(zhì)量的好壞成為影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一個(gè)至關(guān)重要的因素．DNA的獲得通常采用的取樣方法有3種：傷害性取樣(Destructivesampling)、非傷害性取樣(Nondestructivesampling)和非損傷性取樣(Non-invasivesampling)…．傷害性取樣是指通過獲得研究對(duì)象的新鮮肌肉、肝臟或者脾等組織提取DNA．這種取樣方式對(duì)于物種的破壞極大，特別是對(duì)于珍稀瀕危物種而言，它的破壞力是毀滅性的因此，許多研究者已經(jīng)放棄了這種取樣方法．非損傷性取樣則是在不觸及或不傷害野生動(dòng)物本身的前提下，通過收集脫落的毛發(fā)或羽毛、糞便、尿液、食物殘?jiān)?含有口腔脫落細(xì)胞)、鹿角、魚鱗和卵殼等不同形式的樣品進(jìn)行遺傳分析的一種取樣方法．該方法的一個(gè)很大的特點(diǎn)是采樣不會(huì)對(duì)動(dòng)物本身產(chǎn)生傷害，但卻很難收集到完整的DNA，目前該方法比較多地應(yīng)用于大型獸類和鳥類的研究中．非傷害性取樣則是通過抽取動(dòng)物的血液、采集毛發(fā)或羽毛、耳、尾或趾等來用以分析無尾兩棲類作為生態(tài)系統(tǒng)中的一個(gè)重要組成部分，在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)、水域生態(tài)系統(tǒng)以及森林生態(tài)系統(tǒng)中都起到非常重要的作用．然而，由于生境的喪失、外來種的入侵、過度的捕獵、紫外光的作用、化學(xué)物質(zhì)的影響H和疾病，以及全球氣候的變化，使得無尾兩棲類的種群急劇減少因此，對(duì)無尾兩棲類的保護(hù)迫在眉睫．目前國(guó)內(nèi)對(duì)于無尾兩棲類的遺傳結(jié)構(gòu)、線粒體序列以及遺傳多樣性等方面的研究仍然采用傷害性取樣方法．采用非傷害性取樣甚至是非損傷性取樣策略在無尾兩棲類的研究中勢(shì)在必行．基于此，本文采用非傷害性取樣方法從無尾兩棲類的血液、腳趾提取DNA樣本，探討了非傷害性取樣技術(shù)在無尾兩棲類保護(hù)遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用。

　　1材料與方法

　　1．1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其處理

　　以采自浙江金華的虎紋蛙(Hoplobatrachurugulosus)3只作為實(shí)驗(yàn)材料．使用注射器對(duì)每一個(gè)體的活體從心臟抽取血液，同時(shí)剪下不同的趾作為標(biāo)記，然后處死，并剪下腿部肌肉作為實(shí)驗(yàn)的對(duì)照樣本．采集到的血樣使用酸性檸檬酸葡萄糖溶液B(ACD)以體積比5：1混合抗凝，剪下的趾用95％乙醇液浸泡，所有的樣本均置于一70℃超低溫冰箱保存．

　　1．2方法

　　1．2．1DNA的提取

　　根據(jù)文獻(xiàn)[10]的方法略作改動(dòng)，具體如下：血液樣本：在常溫下解凍含有抗凝劑的血液樣本，取100IxL于離心管中，加入250txL抽提緩沖液(0．01mol／L的Tris-HC1(pH8．0)，0．mol／L的乙二胺四乙酸二鈉(EDTA，pH8．0)5g／L十二烷基硫酸鈉)，離心(5000r／min，10rain)，去上清液，在沉淀物中加人100IxL抽提緩沖液和5L蛋白酶K溶液(pK)，37℃水浴4h．趾樣本：取0．1g95％乙醇液浸泡的趾組織使用雙蒸水反復(fù)沖洗掉表面的乙醇并剪碎，加入500L抽提緩沖液和5LpK，55℃水浴4h，離心(9000r／min，10min)后取上清液．肌肉樣本：常溫下解凍肌肉樣本，取0．1g肌肉組織剪碎于離心管中，加入500IxL抽提緩沖液和5LpK，55℃水浴4h，離心(9000r／min，10rain)后取上清液．

　　在上述處理過的樣本中加入等體積的飽和苯酚溶液，混勻(500r／rain，15rain)，離心(9000r／min，15min)，取上清液；之后，加入等體積的氯仿-異戊醇(體積比24：1)，混勻(500r／min，15min)，離心(9000r／min，15min)，取上清液并加入2．5倍體積的預(yù)冷的無水乙醇，置于一20℃冰箱沉淀DNA2h或以上；棄上清液后用70％乙醇液洗滌DNA，真空干燥，加入100LTE(0．01moVLTris—HC1，0．1mol／LEDTA)溶解DNA，于一20℃保存．

　　1．2．2DNA的檢測(cè)

　　選擇線粒體16SrRNA和核DNA的微衛(wèi)星位點(diǎn)引物Hrug01進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，以檢驗(yàn)DNA在遺傳分析中的可用性．PCR反應(yīng)體系為25含2mmoL／L或1．5mmo~LMgC12，0．15mmol／L三磷酸脫氧核糖核苷，0．06mmo~L引物，0．75UTaq聚合酶，模板DNA50ng，10mmoVLTrisHCI，50mmoVLKC1，雙蒸水補(bǔ)足到25L．反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性4min；95變性30s，55oC或50℃退火30s，72℃延伸40s，循環(huán)35次；72℃再延伸10min．?dāng)U增產(chǎn)物在溴化乙錠染色的1％瓊脂糖凝膠中電泳，紫外燈下觀察電泳結(jié)果．

　　2結(jié)果

　　對(duì)所提取的DNA和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示：從血液和趾提取的DNA含量與從肌肉提取的DNA含量相當(dāng)，均能獲得較高的DNA產(chǎn)量(見圖1)．此外，使用3種樣本進(jìn)行16SrRNA和微衛(wèi)星PCR擴(kuò)增均能獲得明顯的擴(kuò)增產(chǎn)物，產(chǎn)物條帶晰，產(chǎn)量高，能夠很好地滿足遺傳學(xué)分析(見圖2和圖3)．

　　3討論

　　3．1血液樣本的提取及保存

　　本文采用活體心臟采血，能夠較好地從動(dòng)物體內(nèi)采集到新鮮血液，采血量?jī)H為50L．由于動(dòng)物體內(nèi)的血液含量約占身體質(zhì)量的5％～8％，所以對(duì)于任何一只大于50g的個(gè)體，采集5OL血液不會(huì)對(duì)動(dòng)物體產(chǎn)生較大的傷害．此外，本實(shí)驗(yàn)選擇酸性檸檬酸葡萄糖溶液B(ACD)作為血液的抗凝劑，是由于經(jīng)B(ACD)抗凝后的血液在DNA的提取和PCR擴(kuò)增中均無明顯的影響．而以肝素抗凝則會(huì)對(duì)后期的DNA提取以及PCR擴(kuò)增產(chǎn)生一定程度的抑制作用；以EDTA抗凝則會(huì)使樣本DNA出現(xiàn)降解．使用血液中的DNA作為模板的不足之處，在于血液的保存時(shí)間不能太長(zhǎng)，時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)造成DNA的降解．在一85℃的條件下保存，保存期限不能超過3個(gè)月；在一70℃下保存，保存期限則不超過2個(gè)月．另外，為了在實(shí)驗(yàn)時(shí)獲得較好的液體狀態(tài)的血液，還應(yīng)該在凍存前對(duì)經(jīng)B(ACD)抗凝的血樣以體積10：1加入細(xì)胞裂解液．

　　3．2趾樣本的提取及保存

　　剪趾法目前在國(guó)外廣泛地應(yīng)用于無尾兩棲類的研究中．采用剪趾法對(duì)所采集的動(dòng)物個(gè)體進(jìn)行標(biāo)記，并將剪下的趾浸泡到乙醇液中保存，不僅可以通過趾提取DNA進(jìn)行遺傳分析，同時(shí)還可以將標(biāo)記過的個(gè)體進(jìn)行標(biāo)志重捕，進(jìn)而研究物種的種群生態(tài)學(xué)問題．此外，從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，使用趾提取的DNA是完全可以滿足遺傳分析需要的．使用乙醇液浸泡趾組織的優(yōu)點(diǎn)在于：乙醇液浸泡會(huì)使蛋白質(zhì)變性，從而達(dá)到防腐的目的；與此同時(shí)，動(dòng)物體內(nèi)的DNA酶也會(huì)喪失活性，從而能夠較好地保存DNA；其次，使用乙醇液保存樣本，對(duì)樣本的影響比較小，保存期限比較長(zhǎng)，完全能夠滿足在較長(zhǎng)一段時(shí)間里的DNA提取和對(duì)該物種的遺傳分析。

　　3．3取樣方法比較

　　在無尾兩棲類分子遺傳學(xué)的研究中，剪趾法在國(guó)外被廣泛地應(yīng)用于相關(guān)研究中，而使用血液為樣本提取DNA研究無尾兩棲類的分子遺傳學(xué)還未見報(bào)道，本文是對(duì)該方法的一次探討和嘗試．從兩棲類動(dòng)物的體內(nèi)抽取血液能夠獲得高質(zhì)量的DNA，但由于在取樣過程中需要使用無菌注射器以及一個(gè)相對(duì)沒有污染的環(huán)境，并且血樣的保存時(shí)間有限，而且由于活體心臟取血技術(shù)有一定的難度，取血的過程也需要耗費(fèi)一定的時(shí)間，所以在野外對(duì)無尾兩棲類的大量取樣中使用血液作為樣本并不是一個(gè)首選的方法，但在僅取少量樣本做快速分析時(shí)則是一個(gè)比較好的取樣方法．使用剪趾法獲得的趾樣本，不僅保存方便，保存時(shí)間長(zhǎng)，并且所需的試劑和工具相對(duì)簡(jiǎn)單，取樣過程方便快捷，其DNA產(chǎn)量也高，能很好地滿足分子遺學(xué)的分析，因而剪趾取樣應(yīng)該是野外采樣中的首選方法．通過血液和趾DNA與肌肉DNA的比較分析，筆者認(rèn)為對(duì)無尾兩棲類完全可以用非傷害性取樣替代原來的肌肉取樣．

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