摘要：為了改變傳統(tǒng)的將兩棲類動物處死后再從肌肉提取DNA的取樣方法，采用非傷害性取樣方法分別采集了虎紋蛙的血液和趾提取DNA，并與從其肌肉中提取的DNA進行了比較，結(jié)果顯示：使用血液和趾提取的DNA產(chǎn)量與肌肉樣本的DNA產(chǎn)量相當；隨后，分別對3種方法取樣的樣本進行了線粒體16SrRNA和核DNA的微衛(wèi)星PCR分析，結(jié)果表明：3種取樣方法所獲得的擴增效果相當，均能滿足虎紋蛙的保護遺傳學研究．因此認為，用非傷害性取樣技術(shù)替代傳統(tǒng)的肌肉取樣的方法在無尾兩棲類的保護遺傳學研究中是切實可行的。

　　關(guān)鍵詞：非傷害性取樣,無尾兩棲類,保護遺傳學,聚合酶鏈反應(yīng)

　　保護遺傳學與分子生態(tài)學的研究已經(jīng)成為現(xiàn)代生物學研究的熱點，作為研究基礎(chǔ)的DNA，其質(zhì)量的好壞成為影響實驗結(jié)果的一個至關(guān)重要的因素．DNA的獲得通常采用的取樣方法有3種：傷害性取樣(Destructivesampling)、非傷害性取樣(Nondestructivesampling)和非損傷性取樣(Non-invasivesampling)…．傷害性取樣是指通過獲得研究對象的新鮮肌肉、肝臟或者脾等組織提取DNA．這種取樣方式對于物種的破壞極大，特別是對于珍稀瀕危物種而言，它的破壞力是毀滅性的因此，許多研究者已經(jīng)放棄了這種取樣方法．非損傷性取樣則是在不觸及或不傷害野生動物本身的前提下，通過收集脫落的毛發(fā)或羽毛、糞便、尿液、食物殘渣(含有口腔脫落細胞)、鹿角、魚鱗和卵殼等不同形式的樣品進行遺傳分析的一種取樣方法．該方法的一個很大的特點是采樣不會對動物本身產(chǎn)生傷害，但卻很難收集到完整的DNA，目前該方法比較多地應(yīng)用于大型獸類和鳥類的研究中．非傷害性取樣則是通過抽取動物的血液、采集毛發(fā)或羽毛、耳、尾或趾等來用以分析無尾兩棲類作為生態(tài)系統(tǒng)中的一個重要組成部分，在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)、水域生態(tài)系統(tǒng)以及森林生態(tài)系統(tǒng)中都起到非常重要的作用．然而，由于生境的喪失、外來種的入侵、過度的捕獵、紫外光的作用、化學物質(zhì)的影響H和疾病，以及全球氣候的變化，使得無尾兩棲類的種群急劇減少因此，對無尾兩棲類的保護迫在眉睫．目前國內(nèi)對于無尾兩棲類的遺傳結(jié)構(gòu)、線粒體序列以及遺傳多樣性等方面的研究仍然采用傷害性取樣方法．采用非傷害性取樣甚至是非損傷性取樣策略在無尾兩棲類的研究中勢在必行．基于此，本文采用非傷害性取樣方法從無尾兩棲類的血液、腳趾提取DNA樣本，探討了非傷害性取樣技術(shù)在無尾兩棲類保護遺傳學研究中的應(yīng)用。

　　1材料與方法

　　1．1實驗動物及其處理

　　以采自浙江金華的虎紋蛙(Hoplobatrachurugulosus)3只作為實驗材料．使用注射器對每一個體的活體從心臟抽取血液，同時剪下不同的趾作為標記，然后處死，并剪下腿部肌肉作為實驗的對照樣本．采集到的血樣使用酸性檸檬酸葡萄糖溶液B(ACD)以體積比5：1混合抗凝，剪下的趾用95％乙醇液浸泡，所有的樣本均置于一70℃超低溫冰箱保存．

　　1．2方法

　　1．2．1DNA的提取

　　根據(jù)文獻[10]的方法略作改動，具體如下：血液樣本：在常溫下解凍含有抗凝劑的血液樣本，取100IxL于離心管中，加入250txL抽提緩沖液(0．01mol／L的Tris-HC1(pH8．0)，0．mol／L的乙二胺四乙酸二鈉(EDTA，pH8．0)5g／L十二烷基硫酸鈉)，離心(5000r／min，10rain)，去上清液，在沉淀物中加人100IxL抽提緩沖液和5L蛋白酶K溶液(pK)，37℃水浴4h．趾樣本：取0．1g95％乙醇液浸泡的趾組織使用雙蒸水反復(fù)沖洗掉表面的乙醇并剪碎，加入500L抽提緩沖液和5LpK，55℃水浴4h，離心(9000r／min，10min)后取上清液．肌肉樣本：常溫下解凍肌肉樣本，取0．1g肌肉組織剪碎于離心管中，加入500IxL抽提緩沖液和5LpK，55℃水浴4h，離心(9000r／min，10rain)后取上清液．

　　在上述處理過的樣本中加入等體積的飽和苯酚溶液，混勻(500r／rain，15rain)，離心(9000r／min，15min)，取上清液；之后，加入等體積的氯仿-異戊醇(體積比24：1)，混勻(500r／min，15min)，離心(9000r／min，15min)，取上清液并加入2．5倍體積的預(yù)冷的無水乙醇，置于一20℃冰箱沉淀DNA2h或以上；棄上清液后用70％乙醇液洗滌DNA，真空干燥，加入100LTE(0．01moVLTris—HC1，0．1mol／LEDTA)溶解DNA，于一20℃保存．

　　1．2．2DNA的檢測

　　選擇線粒體16SrRNA和核DNA的微衛(wèi)星位點引物Hrug01進行PCR擴增反應(yīng)，以檢驗DNA在遺傳分析中的可用性．PCR反應(yīng)體系為25含2mmoL／L或1．5mmo~LMgC12，0．15mmol／L三磷酸脫氧核糖核苷，0．06mmo~L引物，0．75UTaq聚合酶，模板DNA50ng，10mmoVLTrisHCI，50mmoVLKC1，雙蒸水補足到25L．反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性4min；95變性30s，55oC或50℃退火30s，72℃延伸40s，循環(huán)35次；72℃再延伸10min．擴增產(chǎn)物在溴化乙錠染色的1％瓊脂糖凝膠中電泳，紫外燈下觀察電泳結(jié)果．

　　2結(jié)果

　　對所提取的DNA和PCR擴增產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示：從血液和趾提取的DNA含量與從肌肉提取的DNA含量相當，均能獲得較高的DNA產(chǎn)量(見圖1)．此外，使用3種樣本進行16SrRNA和微衛(wèi)星PCR擴增均能獲得明顯的擴增產(chǎn)物，產(chǎn)物條帶晰，產(chǎn)量高，能夠很好地滿足遺傳學分析(見圖2和圖3)．

　　3討論

　　3．1血液樣本的提取及保存

　　本文采用活體心臟采血，能夠較好地從動物體內(nèi)采集到新鮮血液，采血量僅為50L．由于動物體內(nèi)的血液含量約占身體質(zhì)量的5％～8％，所以對于任何一只大于50g的個體，采集5OL血液不會對動物體產(chǎn)生較大的傷害．此外，本實驗選擇酸性檸檬酸葡萄糖溶液B(ACD)作為血液的抗凝劑，是由于經(jīng)B(ACD)抗凝后的血液在DNA的提取和PCR擴增中均無明顯的影響．而以肝素抗凝則會對后期的DNA提取以及PCR擴增產(chǎn)生一定程度的抑制作用；以EDTA抗凝則會使樣本DNA出現(xiàn)降解．使用血液中的DNA作為模板的不足之處，在于血液的保存時間不能太長，時間過長會造成DNA的降解．在一85℃的條件下保存，保存期限不能超過3個月；在一70℃下保存，保存期限則不超過2個月．另外，為了在實驗時獲得較好的液體狀態(tài)的血液，還應(yīng)該在凍存前對經(jīng)B(ACD)抗凝的血樣以體積10：1加入細胞裂解液．

　　3．2趾樣本的提取及保存

　　剪趾法目前在國外廣泛地應(yīng)用于無尾兩棲類的研究中．采用剪趾法對所采集的動物個體進行標記，并將剪下的趾浸泡到乙醇液中保存，不僅可以通過趾提取DNA進行遺傳分析，同時還可以將標記過的個體進行標志重捕，進而研究物種的種群生態(tài)學問題．此外，從本實驗結(jié)果來看，使用趾提取的DNA是完全可以滿足遺傳分析需要的．使用乙醇液浸泡趾組織的優(yōu)點在于：乙醇液浸泡會使蛋白質(zhì)變性，從而達到防腐的目的；與此同時，動物體內(nèi)的DNA酶也會喪失活性，從而能夠較好地保存DNA；其次，使用乙醇液保存樣本，對樣本的影響比較小，保存期限比較長，完全能夠滿足在較長一段時間里的DNA提取和對該物種的遺傳分析。

　　3．3取樣方法比較

　　在無尾兩棲類分子遺傳學的研究中，剪趾法在國外被廣泛地應(yīng)用于相關(guān)研究中，而使用血液為樣本提取DNA研究無尾兩棲類的分子遺傳學還未見報道，本文是對該方法的一次探討和嘗試．從兩棲類動物的體內(nèi)抽取血液能夠獲得高質(zhì)量的DNA，但由于在取樣過程中需要使用無菌注射器以及一個相對沒有污染的環(huán)境，并且血樣的保存時間有限，而且由于活體心臟取血技術(shù)有一定的難度，取血的過程也需要耗費一定的時間，所以在野外對無尾兩棲類的大量取樣中使用血液作為樣本并不是一個首選的方法，但在僅取少量樣本做快速分析時則是一個比較好的取樣方法．使用剪趾法獲得的趾樣本，不僅保存方便，保存時間長，并且所需的試劑和工具相對簡單，取樣過程方便快捷，其DNA產(chǎn)量也高，能很好地滿足分子遺學的分析，因而剪趾取樣應(yīng)該是野外采樣中的首選方法．通過血液和趾DNA與肌肉DNA的比較分析，筆者認為對無尾兩棲類完全可以用非傷害性取樣替代原來的肌肉取樣．

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