宏基因組學(xué)源于20世紀(jì)70年代土壤微生物基因組DNA的直接提取技術(shù)的實(shí)現(xiàn)，隨著微生物學(xué)和生物技術(shù)的不斷發(fā)展，Handelsman于1998年提出了宏基因組學(xué)的概念。生物學(xué)研究論文發(fā)表期刊推薦《生物技術(shù)通報(bào)》（月刊）創(chuàng)刊于1985年，是由中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部主管、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)信息研究所主辦的國(guó)家級(jí)綜合性科技刊物。
　　摘要:土壤宏基因組學(xué)技術(shù)是近來(lái)發(fā)展比較迅速的一種新方法，是研究土壤微生物生態(tài)學(xué)的基礎(chǔ)，也是獲是土壤中各種基因資源的一種有效手段。介紹了土壤宏基因文庫(kù)的構(gòu)建、篩選及土壤宏基因組研究現(xiàn)狀和這一技術(shù)的局限性。

　　關(guān)鍵詞:土壤宏基因組學(xué),研究進(jìn)展,局限性

　　宏基因組學(xué)又叫環(huán)境基因組學(xué)（EnvironmentalGenomics）或群體基因組學(xué)（CommunityGenomics），定義為利用現(xiàn)代基因組技術(shù)直接研究自然狀態(tài)環(huán)境中的有機(jī)體群落，而不需要分離、培養(yǎng)單一種類的微生物。生物學(xué)和化學(xué)的結(jié)合孕育了宏基因組學(xué)的誕生，而宏基因組學(xué)的發(fā)展需要最大限度的利用現(xiàn)代生物技術(shù)和實(shí)用篩選技術(shù)。

　　土壤宏基因組學(xué)技術(shù)是近來(lái)發(fā)展比較迅速的一種新方法[2]，這種方法從土壤環(huán)境樣品中直接提取微生物基因組DNA（宏基因組）并克隆于不同載體，再將重組載體轉(zhuǎn)移到適宜的宿主以建立宏基因組文庫(kù)；同時(shí)結(jié)合不同的篩選技術(shù)，從基因文庫(kù)中篩選新基因或新的生物活性物質(zhì)。應(yīng)用這些免培養(yǎng)的新方法和新技術(shù)，可以繞過(guò)微生物菌種分離培養(yǎng)這一技術(shù)難關(guān)，直接在基因水平上研究、開(kāi)發(fā)和利用無(wú)法培養(yǎng)的微生物資源；有利于揭示不可培養(yǎng)微生物的基因多樣性，為農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展提供豐富的資源。

　�。蓖寥篮昊�因文庫(kù)的構(gòu)建

　　關(guān)于土壤宏基因組學(xué)技術(shù)的構(gòu)建已有許多研究報(bào)道[3]，文庫(kù)的構(gòu)建需要足夠高質(zhì)量的DNA，由于土壤微生物往往會(huì)與土壤其他組分緊密結(jié)合，這就增加了提取土壤DNA的難度[4]。常用的方法包括直接提取法和間接提取法。直接提取法是將樣品直接懸浮在裂解緩沖液中處理，使其釋放DNA，繼而抽提純化；間接提取法是首先去除土壤等雜質(zhì)，通過(guò)不同的離心速度從土壤中分離出細(xì)胞，然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行抽提。直接提取法提取的DNA片段較�。�1~50kb），提取率高，操作簡(jiǎn)單；間接提取法提取的片斷較大（20~500kb），純度高，但操作繁瑣，有些微生物在分離過(guò)程中會(huì)丟失。

　　根據(jù)插入片斷大小，可以把基因文庫(kù)分成2類：質(zhì)粒載體的小片段插入（小于15kb）和柯斯質(zhì)粒（15~40kb）或BAC（細(xì)菌人工染色體）（超過(guò)40kb）載體的大片段插入。大腸桿菌（Escherichiacoli）是表達(dá)土壤細(xì)菌基因或基因簇的通用宿主，穿梭載體或BAC文庫(kù)可將大腸桿菌包含的文庫(kù)信息轉(zhuǎn)移至其他宿主如鏈霉菌或假單胞菌[5]。

　　載體系統(tǒng)的選擇取決于所提取土壤DNA的質(zhì)量及研究目的，包括欲插入目的片段的大小、所需要的載體拷貝數(shù)、使用的宿主以及篩選方法等。如對(duì)腐殖質(zhì)含量較高或剪切較嚴(yán)重的DNA樣品適宜構(gòu)建質(zhì)粒文庫(kù)，小片段的文庫(kù)適用于篩選新的與代謝相關(guān)的單基因或小操縱子；而對(duì)于含較大基因簇或大片段的DNA樣品則需要構(gòu)建大片段和大容量的載體文庫(kù)。Rondon直接把環(huán)境DNA克隆到低拷貝BAC載體，以大腸桿菌作為宿主構(gòu)建了含100Mbp的小文庫(kù)（SL1），

　　并從這個(gè)文庫(kù)中檢測(cè)到DNA酶、脂肪酶、淀粉水解酶的活性。

　�。餐寥篮昊�因組文庫(kù)的篩選

　　宏基因文庫(kù)的篩選主要有功能驅(qū)動(dòng)篩選、化合物結(jié)構(gòu)水平的篩選、序列驅(qū)動(dòng)篩選，底物誘導(dǎo)基因表達(dá)篩選。功能驅(qū)動(dòng)篩選是根據(jù)重組克隆產(chǎn)生的新活性進(jìn)行篩選，在工業(yè)上有很多重要的酶就是用這種方法發(fā)現(xiàn)的。其主要缺點(diǎn)是要在寄主中進(jìn)行功能表達(dá)，造成篩選工作量大，效率低�；�合物結(jié)構(gòu)水平的篩選是根據(jù)不同結(jié)構(gòu)的物質(zhì)在色譜中有不同的峰值，通過(guò)比較轉(zhuǎn)入和未轉(zhuǎn)入外源基因的宿主細(xì)胞或發(fā)酵液抽提物的色譜圖篩選產(chǎn)生新結(jié)構(gòu)化合物的克隆子。此方法工作量大，費(fèi)用高。序列驅(qū)動(dòng)篩選是不依賴重組基因在宿主中表達(dá)來(lái)篩選，而是根據(jù)已知功能的基因序列設(shè)計(jì)探針或PCR引物，通過(guò)雜交進(jìn)行篩選具有目標(biāo)序列的克隆子。底物誘導(dǎo)基因表達(dá)篩選是利用底物誘導(dǎo)克隆子分解代謝基因進(jìn)行篩選，這種方法已經(jīng)成功的從宏基因中篩選出芳烴化合物誘導(dǎo)的基因。國(guó)內(nèi)外的資料顯示這4種篩選方法可以篩選到所需要的物質(zhì)，但篩選效率低，費(fèi)用高。

　�。惩寥篮昊�因組研究現(xiàn)狀

　　利用宏基因組學(xué)的技術(shù)，科研人員篩選到了許多功能基因，加拿大TerraGenDiscover公司最先在以鏈霉菌為宿主的宏基因組文庫(kù)中篩選到了具有抗菌活性的5種新的小分子物質(zhì)TerragineA、B、C、D、E[5]；Courtois等利用柯斯載體構(gòu)建了含5000個(gè)克隆子的環(huán)境基因組文庫(kù)，采用PCR序列分析的方法，篩選出編碼聚酮合成酶的新基因，同時(shí)采用HPLC技術(shù)發(fā)現(xiàn)了脂肪二烯醇中2種新的化合物，兩者互為同分異構(gòu)體；Yun等選用pUC19為克隆載體構(gòu)建大腸桿菌基因組文庫(kù)，利用活性篩選方法，從30000個(gè)重組子中篩選出1個(gè)含淀粉酶基因（amyM）的克隆子。

　　2005年，LimHK等以枯草芽孢桿菌為宿主，建立了森林土壤的宏基因組文庫(kù)，篩選到2個(gè)具有抗菌活性的克隆，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，得出其中一個(gè)為產(chǎn)紅色色素的靛玉紅，另一個(gè)為產(chǎn)藍(lán)色色素的靛藍(lán)，是靛玉紅的異構(gòu)體。2006年，VogetS等首次研究了從土壤宏基因組文庫(kù)中篩選到的一種纖維素酶的性質(zhì)，證實(shí)了其具有較廣的pH值和溫度適應(yīng)范圍，并且在較高的鹽度時(shí)也具有活性，具有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

　�。赐寥篮昊�因組學(xué)的技術(shù)局限性

　　總DNA提取技術(shù)尚存在一定的限制，土壤環(huán)境中，由于微生物與土壤顆粒緊密結(jié)合的特性以及腐殖酸等抑制性物質(zhì)存在等原因，從中難以獲得適于構(gòu)建宏基因組文庫(kù)的高分子量DNA。Bertrand等采用間接提取法，通過(guò)Nycodenz梯度離心，所回收的土壤DNA片段大小己能達(dá)到400kbp，但至今基于原位裂解獲得>100kbp土壤DNA的提取技術(shù)尚未突破，運(yùn)用原位裂解法構(gòu)建更大片段環(huán)境宏基因組文庫(kù)（現(xiàn)有的土壤宏基因組文庫(kù)中，平均插人片段最大為44.5kb）仍是一個(gè)難點(diǎn)。不可避免地，環(huán)境宏基因組文庫(kù)所包含微生物基因組信息的偏差將直接導(dǎo)致“基因遺漏”現(xiàn)象發(fā)生，如海洋中普遍存在的微生物固氮基因，卻在測(cè)序量高達(dá)1.6Gbp的馬尾藻海水宏基因組文庫(kù)中被遺漏，表明僅運(yùn)用宏基因組學(xué)技術(shù)同樣會(huì)忽略部分的微生物資源。

　　陽(yáng)性克隆篩選頻率低是宏基因組學(xué)的另一個(gè)瓶頸所在，運(yùn)用經(jīng)典的功能篩選方式，往往是在數(shù)千個(gè)，甚至數(shù)百萬(wàn)個(gè)重組克隆子中才能檢測(cè)到有用的活性克隆，造成此局面一個(gè)重要的原因是外源基因的異源表達(dá)水平低下。目前根據(jù)核酸序列相似性及基因保守區(qū)設(shè)計(jì)探針或引物的雜交、PCR篩選方法，從文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)新基因的比率尚不到已知基因的40%。

　　環(huán)境微生物宏基因組研究能讓我們發(fā)現(xiàn)存在于不可培養(yǎng)微生物中的一些重要的生理過(guò)程。許多實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)開(kāi)始努力從不可培養(yǎng)土壤生物的基因組序列中去獲得重要的基因，特別是從Acidobacterium組中，因?yàn)樗�是土壤中最常�?jiàn)的細(xì)菌。這些數(shù)據(jù)提供了關(guān)于這些生物在土壤中扮演角色的線索。隨著足夠序列信息的獲得，這些生物的代謝途徑將被構(gòu)建出來(lái)，引導(dǎo)我們采取有效的策略去培養(yǎng)這些生物。這些數(shù)據(jù)也將準(zhǔn)許我們構(gòu)建包含所有已知開(kāi)放閱讀框的微生物芯片，來(lái)確定這些基因在時(shí)間和空間上的表達(dá)狀況。

　　盡管宏基因組技術(shù)本身還存在著一些局限性，但它為土壤微生物的研究提供了一種有效的研究策略，尤其是對(duì)于９９％以上不能獲得純培養(yǎng)的土壤微生物來(lái)說(shuō)，宏基因組學(xué)不僅是研究土壤微生物生態(tài)學(xué)的堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，更是我們獲得土壤中各種基因資源的一個(gè)有效手段。

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