省級期刊論文發(fā)表金龜子綠僵菌液體深層培養(yǎng)研究
摘要 對金龜子綠僵菌30103菌株在不同濃度吐溫80、不同維生素液體培養(yǎng)基中進行液體深層培養(yǎng)研究，結果表明：不同濃度吐溫80對液生分生孢子的產(chǎn)量影響顯著，培養(yǎng)基中吐溫80含量在0.6%～1.0%時，可獲最大產(chǎn)孢量;不同維生素對生物量和液生分生孢子的產(chǎn)量影響顯著，在培養(yǎng)基中添加適宜維生素能有效刺激液生分生孢子的形成，復合維生素、B2B1B6、B6B1H能使綠僵菌獲得較高的液生分生孢子產(chǎn)量。
關鍵詞 省級期刊論文發(fā)表,金龜子綠僵菌,液生芽孢子,液生分生孢子,生物量
綠僵菌在液體深層培養(yǎng)中某些菌株能以微循環(huán)產(chǎn)孢方式，即不經(jīng)營養(yǎng)生長階段，直接從液生芽孢子上形成液生分生孢子[1-2]。這種產(chǎn)孢現(xiàn)象的發(fā)生與培養(yǎng)液的成分和條件密切相關，該文研究在液體培養(yǎng)基中不同濃度吐溫80、不同維生素影響綠僵菌的微循環(huán)產(chǎn)孢進程。
1 材料與方法
1.1 試驗材料
1.1.1 菌株。金龜子綠韁菌(Metarrhizzium anisopliae)30103。
1.1.2 培養(yǎng)液成分。①不同培養(yǎng)時間的培養(yǎng)液成分。碳素：蔗糖(25 g/L)，氮源：花生餅粉(15 g/L)，基礎鹽：KH2PO4(1.5 g/L)、MgSO4·7H2O(0.5 g/L)、CaCl2(0.01 g/L)，微量元素：H3BO3(0.03 mg/L)、Na2MoO4·2H2O(0.05 mg/L)、CuSO4·5H2O(0.08 mg/L)、FeCl3·6H2O(0.5 mg/L)，維生素：B1(15 μg/g)、B6(100 μg/g)、H(15 μg/g)，pH值6.5，吐溫80濃度0.6%。②不同濃度吐溫培養(yǎng)液成分。碳素：蔗糖(25 g/L)，氮源：花生餅粉(15 g/L)，基礎鹽：KH2PO4(1.5 g/L)、MgSO4·7H2O(0.5 g/L)、CaCl2(0.01 g/L)，微量元素：H3BO3(0.03 mg/L)、Na2MoO4·2H2O(0.05 mg/L)、CuSO4·5H2O(0.08 mg/L)、FeCl3·6H2O(0.5 mg/L)，維生素：B1(15μg/g)、B6(100 μg/g)、H(15 μg/g)，pH值6.5，吐溫80濃度：0、0.05%、0.10%、0.20%、0.40%、0.60%、0.80%、1.00%、1.20%、1.40%。③不同維生素培養(yǎng)液成分。碳素：蔗糖(25 g/L)，氮源：花生餅粉(15 g/L)，基礎鹽：KH2PO4(1.5 mg/L)、MgSO4·7H2O(0.5 mg/L)、CaCl2(0.01 mg/L)，微量元素：H3BO3(0.03 mg/L)、Na2MoO4·2H2O(0.05 mg/L)、CuSO4·5H2O(0.08 mg/L)、FeCl3·6H2O(0.5 mg/L)，維生素：B1(15 μg/g)、B6(100 μg/g)、H(15 μg/g)，pH值6.5，吐溫80濃度0.6%。維生素(15 μg/g)：B1、B2、B6、C、H、B4、右旋泛酸鈣、復合維生素、B2B1、B2B6、B6B4、B6右旋泛酸鈣、B2B1C、B1B2B6、B2CH、B2B4右旋泛酸鈣、B6B1C、B6B1H、B6CH、B6B4右旋泛酸鈣、B2C、B2H、B6B1、B6H。
1.2 接種培養(yǎng)
1.2.1 接種懸浮液制備。取供試斜面菌種分別加入含0.05%吐溫80無菌水，用無菌操作的方法打散混勻，稀釋并用血球計數(shù)板準確測定其含孢量達1×106個/mL，用250 mL的三角燒瓶裝入49 mL培養(yǎng)液滅菌，接入1 mL孢子懸浮液，接種量為1×106個，設3次重復，恒溫搖床培養(yǎng)，溫度為(25±1)℃，振蕩頻率130 r/min[3-4]。
1.2.2 觀察測定。接種后每隔12 h用無菌吸管取樣觀察生長情況，有液生孢子出現(xiàn)且用血球計數(shù)板計數(shù)時進行計數(shù)(個/mL)，生物量用于物質稱量法測定(培養(yǎng)液過濾，120 ℃烘箱烘干2 h后稱重)[5-6]。
2 結果與分析
2.1 液體產(chǎn)物形成過程和形態(tài)
振蕩培養(yǎng)24 h，孢子開始萌發(fā)，原生質轉移到芽管生長點，芽管自孢子一端或二端或四周均有伸出。48 h菌體呈網(wǎng)狀，形成黃色菌團或散生。60 h菌體出現(xiàn)產(chǎn)孢結構，開始形成液生芽孢子，芽孢子呈長卵形。72 h后芽孢子大量形成，部分芽孢子以微循環(huán)產(chǎn)孢方式，直接從芽孢子上形成分生孢子，液生分生孢子卵球形，與氣生分生孢子有明顯差異，此后液生分生孢子產(chǎn)量逐漸增加，120～144 h達到最高產(chǎn)量。
2.2 不同濃度吐溫80對生物量、液生孢子形成的影響
表2為不同濃度吐溫80培養(yǎng)液振蕩培養(yǎng)144 h后生物量及液生分生孢子產(chǎn)孢情況。經(jīng)方差分析可知，吐溫80對生物量影響不顯著，F(xiàn)=0.54F0.01(9，20)=3.46。吐溫80對液生分生孢子的產(chǎn)量影響極顯著，F(xiàn)=6.28>F0.01(9，20)=3.46，培養(yǎng)基中吐溫含量在0.6%～1.0%時，有利于綠僵菌液生分生孢子的形成。
2.3 不同維生素對生物量、液生孢子形成的影響
表3為不同維生素培養(yǎng)液振蕩培養(yǎng)144 h后生物量及液生分生孢子產(chǎn)孢情況。經(jīng)方差分析可知，不同維生素對生物量影響極顯著，F(xiàn)=5.45>F0.01(24，50)=2.18。不同維生素對液生芽孢子的形成影響達極顯著水平，F(xiàn)=28.39>F0.01(24，50)=2.18。不同維生素對液生分生孢子的產(chǎn)量影響極顯著，F(xiàn)=12.46>F0.01(9，20)=2.18。不同維生素對生物量、液生芽孢子、液生分生孢子的產(chǎn)量影響極顯著，生長良好狀況有復合維生素、B2B1B6、B6B1H等。復雜的維生素組合比單一的維生素液分生孢子的產(chǎn)量高，未添加維生素的對照組產(chǎn)孢量最低。
3 結論與討論
不同濃度吐溫80對綠僵菌液生分生孢子的產(chǎn)量影響差異極顯著，培養(yǎng)基中吐溫80含量在0.6%～1.0%，可獲最大產(chǎn)孢量。適宜吐溫含量，培養(yǎng)液的黏稠度適中，菌體不易徒長，與此同時又形成發(fā)育良好的菌絲團，產(chǎn)孢結構發(fā)育充分，產(chǎn)孢點多，產(chǎn)孢量大。
不同維生素對綠僵菌生物量、液生分生孢子的產(chǎn)量影響差異極顯著，生長良好狀況有復合維生素、B2B1B6、B6B1H等�？梢姡囵B(yǎng)液中添加適宜的維生素作為生長輔助因子，能有效促進生物量、液生芽孢子和液生分生孢子的產(chǎn)量，從而構成一條良好的產(chǎn)孢路線，為進一步研究液體深層發(fā)酵產(chǎn)生綠僵菌分生孢子提供參考價值。
4 參考文獻
[1] 樊美珍，郭超，薛文奇，等.金龜子綠韁菌液體深層培養(yǎng)初探[J].中國蟲草真菌研究與應用，1993(3)：146-149.
[2] 宋漳.九株綠僵菌液體振蕩培養(yǎng)初步研究[J].福建林學院報，1996，16(1)：38-40.
[3] VEZINA C，SINGMH K，SEHGALS N.Sporulation of filamentous fungi in submerged culture[J].Mycologia，1965，57(5)：722-736.
[4] 葉小真，陳全助，宋漳.10種化學殺蟲劑對金龜子綠僵菌生物學性狀的影響[J].福建林學院學報，2012，32(2)：169-173.
