近年來，微流體技術(shù)（Microfluidicstechnology）快速發(fā)展[1，2]，已在化學(xué)、醫(yī)藥及生命科學(xué)等領(lǐng)域引起廣泛關(guān)注。微流體芯片，又稱為“芯片實(shí)驗(yàn)室”（Lab-on-a-chip）[3]，利用微機(jī)電技術(shù)將一般實(shí)驗(yàn)室所使用的分離、反應(yīng)、混合等裝置微小化到芯片上，以進(jìn)行生化反應(yīng)、分析，可以對微量流體進(jìn)行復(fù)雜、精確的操作，因其具有體積輕巧、使用樣品和試劑量少、反應(yīng)速度快、平行處理大量樣品等優(yōu)點(diǎn)[4～6]，在生物分析技術(shù)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[7～9]。

　　摘要：將磁敏傳感器與微流體測試卡集成，研制了可快速檢測多靶標(biāo)生物標(biāo)志物的微流體免疫磁敏傳感器。以3種消化系統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物（甲胎蛋白、癌胚抗原、糖鏈抗原）為模型靶標(biāo)，對免疫反應(yīng)各步反應(yīng)的液體流速、免疫反應(yīng)時(shí)間以及反應(yīng)后的沖洗速度進(jìn)行了優(yōu)化，評價(jià)了多靶標(biāo)同時(shí)檢測的系統(tǒng)性能。在微流體磁敏生物傳感器系統(tǒng)中，建立了血清樣本中3種靶標(biāo)同時(shí)檢測的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，AFP、CEA和CA19-9的檢出限分別達(dá)到0.1μg/L、0.1μg/L和30U/mL，線性范圍跨越4個(gè)數(shù)量級。微流體磁敏生物傳感器可在30min內(nèi)完成多靶標(biāo)生物標(biāo)志物檢測，臨床血清樣本的測試結(jié)果與ELISA法一致，具有檢測時(shí)間短、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。

　　關(guān)鍵詞：微流體,磁敏傳感器,多靶標(biāo)生物標(biāo)志物

　　1引言

　　生物傳感器技術(shù)[10～12]作為生物分析技術(shù)中的一個(gè)重要分支，結(jié)合了生命科學(xué)、分析化學(xué)、物理學(xué)、計(jì)算機(jī)信息科學(xué)等相關(guān)技術(shù)，能夠?qū)Υ龣z物質(zhì)進(jìn)行快速分析，在醫(yī)療檢測、環(huán)境監(jiān)測、食品安全、軍事安全等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。其中，磁隧道結(jié)（Magnetictunneljunction，MTJ）傳感器[10～16]是一種利用巨磁阻效應(yīng)的新型生物傳感器，以超順磁顆粒為檢測探針，具有體積小、成本低、生物背景低、靈敏度高、高通量等特點(diǎn)，有望為生物學(xué)[10～14]、藥學(xué)研究[15]、醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)[16]等領(lǐng)域提供便攜、快捷的新技術(shù)平臺。

　　腫瘤標(biāo)志物是指在腫瘤的發(fā)生和增殖過程中，由腫瘤細(xì)胞本身所產(chǎn)生或由機(jī)體對腫瘤細(xì)胞反應(yīng)而產(chǎn)生的，反映腫瘤存在種生長的一類物質(zhì)。多種腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)合檢測能夠提高診斷的準(zhǔn)確性，上廣泛應(yīng)用于不同類型腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)和診療[17～20]。目前的腫瘤標(biāo)志物檢測方法主要有酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）、放射免疫分析法、熒光免疫分析法和膠體金試紙條檢測等，這些方法多是針對單個(gè)標(biāo)志物的單靶標(biāo)測試，且耗時(shí)長，操作較復(fù)雜。結(jié)合微流體技術(shù)檢測體系，可以提高自動化程度；磁敏傳感器檢測技術(shù)，可以進(jìn)行高靈敏度、高通量、多靶標(biāo)的快速測試，可以為腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)合檢測提供高效的檢測方法。

　　本研究以磁敏傳感器為平臺，設(shè)計(jì)并建立研制了一種芯片上的微流體磁敏生物傳感器，評價(jià)了基于磁敏傳感器的消化系統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物多靶標(biāo)定量檢測的可行性。

　　2實(shí)驗(yàn)部分

　　2.1儀器與試劑

　　磁敏傳感器檢測儀樣機(jī)及配套磁敏傳感器測試卡（40mm×50mm）由東莞博識生物科技有限公司與中國科學(xué)院理化技術(shù)研究所聯(lián)合研制；MTJ傳感器陣列（6.6mm×10.7mm×0.75mm，MagicTechnologies，US）；DZF-6020型真空干燥箱；L0107-1A注射泵（保定蘭格恒流泵有限公司）；BX51熒光顯微鏡（Olympus公司）；EASYpureLF超純水系統(tǒng)（美國Barnstead公司）。

　　甲胎蛋白（AFP）抗原標(biāo)準(zhǔn)品、癌胚抗原（CEA）標(biāo)準(zhǔn)品、糖鏈抗原（CA19-9）標(biāo)準(zhǔn)品、抗AFP包被抗體、抗CEA包被抗體、抗CA19-9包被抗體、Biotin標(biāo)記抗AFP抗體、Biotin標(biāo)記抗CEA抗體、Biotin標(biāo)記抗CA19-9抗體（美國FitzgeraldIndustriesInternational公司）；牛血清白蛋白（BSA，北京欣經(jīng)科生物技術(shù)公司）；優(yōu)級純胎牛血清（北京欣經(jīng)科生物技術(shù)公司）；親和素-超順磁顆粒（Avidin-beads，法國Ademtech公司）；3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷（GPTS，97%，美國AlfaAesar公司）；Na2HPO4，KH2PO4，Na2CO3和NaHCO3（美國Merck公司）；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

　　2.2磁敏傳感器免疫測試原理

　　磁敏傳感器是以超順磁顆粒作為探針，通過MTJ傳感器陣列芯片對生物分子捕捉到的超順磁顆粒的響應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對芯片表面的生物分子進(jìn)行分析檢測。在外加磁場作用下，超順磁顆粒被磁化、產(chǎn)生磁場（圖1），磁顆粒產(chǎn)生的磁場干擾下方的MTJ傳感器，使其產(chǎn)生電阻率變化、進(jìn)面轉(zhuǎn)化為電流信號變化，即得到磁顆粒數(shù)目的信號[16]。腫瘤標(biāo)志物的檢測是使用夾心免疫反應(yīng)原理，芯片表面的第一抗體（1stAntibody）、血樣中的抗原（Antigen）與生物素修飾的第二抗體（2ndAntibody-Biotin）通過特異的免疫反應(yīng)，形成夾心結(jié)構(gòu)；超順磁顆粒（Avidin-Bead）上的親和素與第二抗體的生物素結(jié)合，從而被捕獲到芯片表面；當(dāng)施加微弱磁場時(shí)，MTJ傳感器感應(yīng)到磁顆粒，產(chǎn)生電流信號，信號大小可以反映出樣品中的抗原濃度，以達(dá)到定量檢測樣品中靶標(biāo)分子的目的。

　　2.3微流體磁敏生物傳感器測試卡的設(shè)計(jì)

　　將修飾了特定抗體的磁敏傳感器集成到微流體測試卡內(nèi)，實(shí)現(xiàn)程序化進(jìn)樣、反應(yīng)、分離和測試。如圖2A所示，整個(gè)測試卡是由樣品舟（Cartridge）、微通道層（PDMSlayer）和芯片印制電路板（PrintedcircuitboardwithMTJchip，PCBwithMTJchip）三層結(jié)構(gòu)構(gòu)成。樣品舟上共有4個(gè)液體注入口，分別為待檢測樣品（Sample）、清洗液（Rinsingbuffer）、生物素修飾的第二抗體（2ndAntibody-biotin）和親和素-磁顆粒（Avidin-beads）。在PDMS層上設(shè)計(jì)有液體流動的微通道，進(jìn)樣口內(nèi)的液體在微量注射泵的驅(qū)動下，依次從不同的進(jìn)樣口流經(jīng)芯片的點(diǎn)樣區(qū)進(jìn)入廢液池，圖2B展示的是測試卡中微流體通道的平面圖。在芯片上不同區(qū)域包被不同抗體，可以達(dá)到多靶標(biāo)同時(shí)測試的目的。[TS（][HT5”SS]圖2MTJ生物傳感器的測試卡設(shè)計(jì)簡圖（A）和微流體通道示意圖（B）

　　Fig.2DesignsketchofMTJbiosensortestcard（A）andfluidicchannel（B）[HT5][TS）]

　　2.4實(shí)驗(yàn)步驟

　　2.4.1緩沖溶液及稀釋液的配制磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH7.4）：以KH2PO4和Na2HPO4配制，并用H3PO4和NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH7.4。包被緩沖液為0.05mol/L碳酸鹽緩沖液（pH9.6）。0.1%BSA-PBST溶液為清洗液、Antibody-Biotin及Avidin-Beads的稀釋液，1%BSA-PBST作為封閉液。標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：取適量抗原標(biāo)準(zhǔn)品，用胎牛血清稀釋至特定濃度使用。以上所有溶液均加入0.04%NaN3，于4℃保存。

　　2.4.2免疫分析過程全部反應(yīng)過程在室溫下進(jìn)行。在3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷處理的芯片表面，用pH9.6的碳酸鹽緩沖液制備的濃度為20mg/L的AFP，CEA，CA19-9抗體包被溶液及BSA溶液，分別取500nL滴加在芯片測試區(qū)域[21]，在濕度為90%的環(huán)境中溫育10min；加入1%BSA-PBST封閉液，5min后將芯片裝入測試卡，向測試卡中注入40μL待測樣品，室溫下樣品中抗原與固定抗體反應(yīng)一定時(shí)間后，用清洗液沖洗，除去游離的抗原；再注入40μL混合標(biāo)記抗體-生物素，室溫下反應(yīng)一定時(shí)間后，注入80μL清洗液；然后注入40μL親和素-磁顆粒，反應(yīng)一定時(shí)間；最后注入80μL清洗液沖洗，去除未反應(yīng)的磁顆粒；將測試卡載入傳感器中讀出磁顆粒數(shù)目，并計(jì)算出磁顆粒數(shù)目與樣品中抗原含量的相關(guān)性。

　　3結(jié)果與討論

　　3.1分析條件的優(yōu)化

　　微流體系統(tǒng)中免疫反應(yīng)的效率受到微通道的液體流速、芯片上的表面張力等因素的影響很大。實(shí)驗(yàn)中通過注射泵在微流體通道中依次注入反應(yīng)液和清洗液，從而實(shí)現(xiàn)微流體中的免疫反應(yīng)和沖洗過程。分析條件的優(yōu)化，主要是篩選反應(yīng)試劑的注入速度、免疫反應(yīng)時(shí)間以及芯片表面的沖洗條件。由于儲液室的體積固定，因此對注入速度和沖洗速度的篩選也就是對試劑注入時(shí)間和清洗液注入時(shí)間的篩選。對3種腫瘤標(biāo)志物分別進(jìn)行了篩選，這里僅列出CEA分析條件的篩選過程。

　　設(shè)定緩和的微流體條件和較充分的反應(yīng)時(shí)間（每步15min），篩選出最佳標(biāo)記抗體和磁顆粒溶液的濃度分別為20μg/mL和1mg/mL（10倍稀釋）。在設(shè)定清洗液體積為80μL的條件下，改變清洗液注入時(shí)間，研究沖洗速度對特異反應(yīng)（抗原為1μg/L）和非特異吸附（抗原為0）的影響。如圖3A所示，非特異吸附的磁顆粒數(shù)目隨沖洗時(shí)間的縮短而略有降低，特異反應(yīng)的磁顆粒數(shù)目隨沖洗時(shí)間的縮短而降低，為了獲得最高的信噪比，最優(yōu)的沖洗條件為在60s內(nèi)注入80μL清洗液。

　　芯片表面的免疫反應(yīng)如圖1所示，血樣中的抗原與芯片上的包被抗體的結(jié)合，直接影響最終的免疫夾心結(jié)構(gòu)的形成，因此抗原溶液的靜置時(shí)間，對腫瘤標(biāo)志物的免疫分析有直接而重要的影響。實(shí)驗(yàn)中篩選了含有CEA抗原的血樣的靜置反應(yīng)時(shí)間（圖3B），在1μg/L抗原濃度下，隨靜置反應(yīng)時(shí)間延長，反應(yīng)區(qū)檢測到的磁顆粒數(shù)目增加，10min后增加幅度變小，基本達(dá)到平衡。對標(biāo)記抗體和磁顆粒溶液的靜態(tài)反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行了篩選，由于二者的使用濃度較高，所以反應(yīng)在5min左右基本達(dá)到飽和。由此確定了腫瘤標(biāo)志物免疫分析中三步免疫反應(yīng)的時(shí)間分別為10，5和5min。[TS（][HT5”SS]圖3沖洗時(shí)間和樣品靜態(tài)反應(yīng)時(shí)間的篩選

　　Fig.3Optimizationoftherinsingtime（A）andstaticreactiontime（B）forcarcino-embryonicantigen（CEA）[HT5][TS）]

　　在微流體傳感器體系中分別篩選了AFP，CEA和CA19-9的測試條件，3種腫瘤標(biāo)志物的最佳反應(yīng)時(shí)間相近，最佳沖洗條件略有差別（表1），故多靶標(biāo)聯(lián)合檢測中選擇60s作為最佳沖洗時(shí)間，使用微流體磁敏生物傳感器，可以在30min內(nèi)同時(shí)進(jìn)行3種腫瘤標(biāo)志物的檢測。

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