大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌是常見(jiàn)的條件致病菌，在免疫抑制、器官移植、獲得性免疫缺陷綜合征等情況下，可導(dǎo)致機(jī)會(huì)性感染[1]，有效控制其感染的主要技術(shù)手段之一為日常消毒。隨著社會(huì)的進(jìn)步，人們對(duì)生活質(zhì)量和環(huán)保認(rèn)識(shí)的日益提高，綠色環(huán)保、易清除、使用安全、無(wú)毒無(wú)味的消毒產(chǎn)品成為首選。因此，由植物中具有殺菌作用的成分或提取物組成的植物消毒劑受到了人們的關(guān)注[2]。槐果堿是一種苦參堿類(lèi)生物堿，在體外能抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的生長(zhǎng)，具有廣譜抗菌作用[3-8];金銀花是常見(jiàn)的植物，在我國(guó)分布廣泛，其活性成分綠原酸類(lèi)物質(zhì)具有良好的抗菌、抗病毒及抗氧化等功效[9-11]。研究表明，不同濃度的綠原酸提取液對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果可達(dá)30%～90%[12]，金銀花提取物對(duì)口腔白色念珠菌也有一定的抑制作用[13]。單一植物消毒產(chǎn)品研發(fā)成本高、抗菌譜窄且易使細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性，將多種抗菌性能良好的活性成分進(jìn)行復(fù)配，可有效擴(kuò)大其抗菌譜，拓寬使用面[14-15]。本研究在原有工作基礎(chǔ)上，采用復(fù)方法，將具有良好抗菌性能的槐果堿、綠原酸和金銀花提取物按一定比例復(fù)配，評(píng)價(jià)其對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的協(xié)同殺菌效果，并對(duì)其物理性能、殺菌能力及穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

　　1材料與方法

　　1.1原料與試劑苦參提取液，槐果堿(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，純度>98%)，金銀花(購(gòu)自衡陽(yáng)市敬一堂大藥房)，用乙酸乙酯和稀鹽酸混合溶液作提取劑，從中提取綠原酸[12];金銀花提取物由上海中藥制劑二廠(chǎng)提供。大腸桿菌(ATCC2592)、金黃色葡萄球菌(ATCC6538)、白色念珠菌(8099，第4代)購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。1.2復(fù)方植物消毒劑的制備將槐果堿-綠原酸-金銀花提取物(5∶4∶1)與3%的Tween-80混合，60℃水浴攪拌30min，然后滴入極少量三氯生乙醇溶液，加入含有苦參提取液的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH8.0)，并補(bǔ)加PBS至90ml，繼續(xù)攪拌1h后，將上述溶液用PBS定容至100ml，即為新型復(fù)方植物消毒劑。與上述步驟相同，不添加槐果堿-綠原酸-金銀花提取物，制備復(fù)合劑，作為空白對(duì)照品。1.3試驗(yàn)菌的制備在無(wú)菌環(huán)境下打開(kāi)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌的凍干菌種管，加入適量營(yíng)養(yǎng)肉湯輕輕吹洗數(shù)次，使菌種充分融化分散;然后取少量菌懸液滴加到5～10ml營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37℃培育18～24h，為第1代菌懸液。用無(wú)菌接種環(huán)挑取第1代菌懸液接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，37℃培育18～24h;取第2代菌落接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，37℃培育18～24h，得到第3代菌。將第3代菌接種于試管斜面上，37℃培養(yǎng)18～24h，保存于4℃冰箱。1.4定量殺滅試驗(yàn)1.4.1染菌樣液的制備分別以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌為試驗(yàn)菌，配制菌懸液，含菌量為1×107～5×107CFU/ml。1.4.2中和劑鑒定試驗(yàn)復(fù)方植物消毒劑原液為待測(cè)消毒劑，用含0.5%硫代硫酸鈉、0.3%卵磷脂、3.0%Tween-80的PBS為中和劑，作用于試驗(yàn)菌0.5min。試驗(yàn)溫度20℃±1℃，重復(fù)3次。試驗(yàn)分為6組：(1)復(fù)方消毒劑+染菌樣液;(2)復(fù)方消毒劑+染菌樣液+4.5ml中和劑;(3)4.5ml中和劑+染菌樣液對(duì)照;(4)復(fù)方消毒劑+4.5ml中和劑+染菌樣液對(duì)照;(5)染菌樣液對(duì)照+4.5ml胰蛋白胨(TPS);(6)試驗(yàn)所用同批次TPS。1.4.3菌懸液定量殺菌試驗(yàn)挑取典型菌落接種于普通瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，加入2～3ml無(wú)菌PBS清洗菌苔，用PBS將試驗(yàn)菌懸液稀釋至1×107～5×107CFU/ml。20℃±1℃下，將0.5ml菌懸液與4.5ml復(fù)方消毒劑混勻，分別作用0.5、1.0、1.5min。取菌樣混合液0.5ml加入4.5ml滅菌的中和劑溶液中，中和作用后取0.1ml接種于普通瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24h，計(jì)數(shù)菌落;同時(shí)以PBS稀釋菌為陰性對(duì)照。重復(fù)3次，取平均值。根據(jù)各組活菌數(shù)(CFU/ml)計(jì)算殺菌率，殺菌率=[(對(duì)照樣品平均菌落數(shù)-被試樣品平均菌落數(shù))/對(duì)照樣品平均菌落數(shù)]×100%。1.5穩(wěn)定性試驗(yàn)將制備好的復(fù)方植物消毒劑原液密封包裝，置于54℃恒溫箱中，存放14d。分別在存放前、存放后觀(guān)察其顏色、澄清度變化及pH值，按定量殺滅試驗(yàn)程序檢測(cè)其殺滅效果。

　　2結(jié)果

　　2.1中和劑鑒定試驗(yàn)在20℃±1℃條件下，用消毒劑原液對(duì)白色念珠菌進(jìn)行中和劑鑒定試驗(yàn)，重復(fù)3次，結(jié)果如表1所示。各組平板菌落平均生長(zhǎng)量為：第1組0CFU/ml，第2組12CFU/ml，第3、4、5組分別為1890000CFU/ml、1870000CFU/ml、1900000CFU/ml，第3、4、5組三組間誤差率為0.53%。表明中和劑可有效中和最高試驗(yàn)濃度新型復(fù)方植物消毒劑對(duì)細(xì)菌的殘余作用，且中和劑對(duì)試驗(yàn)菌無(wú)明顯影響。2.2新型復(fù)方植物消毒劑殺菌效果新型復(fù)方植物消毒劑原液對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌分別作用0.5、1.0、1.5min，結(jié)果如表2所示。新型復(fù)方植物消毒劑原液作用0.5min時(shí)，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的殺菌率≥99.97%;作用1min殺菌率均達(dá)到100.00%。2.3新型復(fù)方植物消毒劑的穩(wěn)定性54℃存放14d后，新型復(fù)方植物消毒劑pH中性，為無(wú)不溶物的深紅色澄清溶液，性狀無(wú)明顯改變。對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌作用1min的滅殺效果，存放前為100.00%，存放后為99.99%(表3)。

　　3討論

　　本研究采用純植物提取物復(fù)合配方法，將綠原酸、槐果堿和金銀花提取物按照一定比例復(fù)配，可充分利用三者的優(yōu)良性能，有效增強(qiáng)了抗菌的廣譜性和抑制效果[3-13]。對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的殺滅效果良好，作用0.5min即可達(dá)到99.97%的滅殺效果;作用1.0min可全部滅殺。同時(shí)，本研究也對(duì)此新型復(fù)方植物消毒劑的顏色、澄清度、pH及殺菌性能的穩(wěn)定性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，經(jīng)過(guò)14d54℃的加速試驗(yàn)，本產(chǎn)品顏色、性狀以及其對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的殺菌效果不變，證明了本產(chǎn)品具有良好的穩(wěn)定性。綜上所述，此新型復(fù)方植物消毒劑具有良好的穩(wěn)定性和殺菌性，能夠滿(mǎn)足抗菌、儲(chǔ)藏等方面的要求。

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　　作者：慈穎 郭美榮 楊燕 李素 王靜 王思 于珊珊 張曉龍

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