目前，油菜是中國(guó)重要的油料作物，其種植面積已經(jīng)達(dá)到了667萬(wàn)hm2，占到了世界油菜種植面積的1/3[1-3];隨著農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整和鄉(xiāng)村振興的發(fā)展，近年來(lái)種植面積還有所增加。在中國(guó)，油菜生產(chǎn)主要集中在長(zhǎng)江流域和西南地區(qū)，約占中國(guó)油菜生產(chǎn)面積的90%~93%[4-5]，但這些地區(qū)多以稻-油或稻-稻-油的輪作方式進(jìn)行種植，田間雜草危害成為制約油菜集約化和機(jī)械化發(fā)展的主要生物逆境因素。當(dāng)前去除油菜田間雜草的主要方式以人工除草為主，隨著城鎮(zhèn)化發(fā)展，農(nóng)村剩余勞動(dòng)力不足，而人工除草耗時(shí)長(zhǎng)，用工量大，顯著增加了油菜種植成本，導(dǎo)致油菜種植效益低下，降低農(nóng)戶種植積極性，制約油菜生產(chǎn)發(fā)展[6];盡管當(dāng)前已有油菜田間封閉除草劑的推廣應(yīng)用，但是噴施時(shí)間范圍有限、受到田間土壤持水量、空氣水分飽和度等因素的影響，往往使用效果不理想，若降雨天氣較多，容易導(dǎo)致油菜田間發(fā)生藥害，因此選育抗除草劑油菜品種是從根本解決化學(xué)除草、提高油菜規(guī)模化、機(jī)械化種植的重要途徑。1985年，Comai將鼠傷寒沙門氏菌的aroA突變基因轉(zhuǎn)移到煙草上，首次獲得抗草甘膦的轉(zhuǎn)基因植物，之后多個(gè)研究者從擬南芥、胡蘿卜、矮牽牛、煙草等植物和農(nóng)桿菌、大腸桿菌等細(xì)菌中分離克隆了多種EPSPS基因[7-11]。1999年，中國(guó)從加拿大引入了抗草甘膦的油菜種質(zhì)資源Q3，該資源具有抗草甘膦CP4基因和草甘膦氧化酶基因gox雙價(jià)基因，伴隨著生物技術(shù)和基因工程的發(fā)展，到目前為止已選育出了一大批具有抗除草劑特性的油菜種質(zhì)資源和品系[12-16]，但這些資源和品系都是轉(zhuǎn)基因油菜，目前中國(guó)的轉(zhuǎn)基因抗除草劑油菜還沒有批準(zhǔn)進(jìn)入商業(yè)化栽培，轉(zhuǎn)基因油菜品種較難應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)踐中。因此，非轉(zhuǎn)基因抗除草劑油菜種質(zhì)資源的創(chuàng)制是解決中國(guó)選育非轉(zhuǎn)基因抗除草劑油菜品種的關(guān)鍵。誘變育種可以通過(guò)物理化學(xué)的方法誘發(fā)有機(jī)體產(chǎn)生遺傳性的變異，通過(guò)人工選擇、鑒定培育新品種的途徑，在不添加外源基因的情況下有效改變已有基因，有效提高品種選育效率，解決轉(zhuǎn)基因存在的不足[17-19]，鑒于此，利用誘變育種的方式選育非轉(zhuǎn)基因抗除草劑油菜品種有利于當(dāng)前油菜生產(chǎn)發(fā)展的需要。本研究探索了利用誘變育種技術(shù)獲得非轉(zhuǎn)基因抗除草劑油菜細(xì)胞質(zhì)保持系資源，進(jìn)而轉(zhuǎn)育成非轉(zhuǎn)基因抗除草劑油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，選育出抗除草劑油菜品種，現(xiàn)把育種方法和品種選育過(guò)程進(jìn)行闡述，以期為選育新的非轉(zhuǎn)基因抗除草劑油菜提供理論借鑒。

　　

 

　　1材料與方法

　　1.1試驗(yàn)材料

　　供試的育種品系均來(lái)源于陜西省雜交油菜研究中心種質(zhì)資源庫(kù)，均不抗除草劑，具體為：誘變材料‘陜9B’，該品系是細(xì)胞質(zhì)雄性不育保持系;轉(zhuǎn)育的母本‘陜9A’，是細(xì)胞質(zhì)雄性不育系;非轉(zhuǎn)基因抗除草劑油菜的父本編號(hào)分別為‘R1’、‘R2’、‘R3’、‘R4’、‘R5’、‘R6’、‘R7’，是細(xì)胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)系;大田品比試驗(yàn)的對(duì)照品種為‘秦優(yōu)7號(hào)’。誘變劑為EMS，除草劑為山東僑昌現(xiàn)代農(nóng)業(yè)有限公司生產(chǎn)的有效成分含量為10%的苯磺隆可濕性粉劑。

　　1.2試驗(yàn)方法

　　1.2.1誘變處理利用0.5%的EMS溶液浸泡‘陜9B’種子16h，浸泡處理完后，用自來(lái)水將其沖洗2h，在人工氣候室內(nèi)，將處理好的種子種植于發(fā)芽盤中，同時(shí)在苗盤中播種未處理的種子做對(duì)照，等種子萌發(fā)長(zhǎng)至兩子葉完全伸展后即用山東僑昌現(xiàn)代農(nóng)業(yè)有限公司生產(chǎn)的有效成分含量為10%的苯磺隆可濕性粉劑，配制成濃度為600mg/L的溶液噴霧處理，同時(shí)對(duì)照也采取相同方法處理;10天后調(diào)查幼苗死亡情況，誘變油菜苗噴施除草劑溶液后將沒有受到除草劑傷害的幼苗移栽到營(yíng)養(yǎng)缽中放在人工氣候室中繼續(xù)生長(zhǎng);在抗性植株花期，對(duì)其套袋自交，成熟期收獲種子;將收獲的抗性種子在秋季播于試驗(yàn)田中，同時(shí)播種未處理的種子做對(duì)照，在油菜生長(zhǎng)到三葉一心期時(shí)噴施除草劑溶液處理，10天后調(diào)查幼苗死亡情況，對(duì)除草劑傷害不明顯的幼苗進(jìn)行二次噴施除草劑以去除假抗性植株，對(duì)正常生長(zhǎng)的誘變抗性植株在花期全部套袋自交，對(duì)每個(gè)抗性植株編號(hào)，成熟期收獲種子后，對(duì)所收獲的抗性種子做抗性基因檢測(cè)和轉(zhuǎn)基因鑒定。1.2.2抗性轉(zhuǎn)育將所收到的抗性種子在花期與非抗除草劑甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系‘陜9A’進(jìn)行雜交，采取多株系單株對(duì)測(cè)。在次年秋季對(duì)所得到雜交組合及相應(yīng)父母本進(jìn)行種植，在三葉一心期時(shí)噴施除草劑溶液處理。對(duì)未受除草劑影響的雜交組合在花期調(diào)查其雄性不育性，同時(shí)對(duì)相應(yīng)父本套袋自交。選擇對(duì)測(cè)組合全為雄性不育的組合與其相應(yīng)父本繼續(xù)進(jìn)行回交，得到BC1代，按照同樣步驟連續(xù)進(jìn)行6代回交，得到具有非轉(zhuǎn)基因抗除草劑特性的純合細(xì)胞質(zhì)雄性不育系。1.2.3雜交組合利用得到的非轉(zhuǎn)基因抗除草劑不育系與恢復(fù)系雜交，配制雜交組合進(jìn)行品比試驗(yàn)。

　　2結(jié)果與分析

　　2.1EMS誘變處理的濃度

　　不同濃度的EMS誘變液處理下‘陜9B’種子的發(fā)芽情況不同(如圖1)。濃度為0.00%的EMS(對(duì)照)誘變液處理下‘陜9B’的發(fā)芽率達(dá)到了100%，而用濃度分別為0.25%、0.5%、0.75%的EMS誘變液處理后的種子，隨著處理濃度的增大，發(fā)芽率降低的幅度逐漸增大，當(dāng)濃度為0.75%時(shí)，發(fā)芽率僅有27%。在不同EMS濃度處理中，0.5%的EMS處理?xiàng)l件下種子發(fā)芽率43.5%;根據(jù)誘變處理的半致死劑量原則，綜合考慮選擇濃度為0.5%的EMS誘變液對(duì)油菜‘陜9B’種子進(jìn)行誘變處理。

　　2.2非轉(zhuǎn)基因抗除草劑保持系的創(chuàng)制

　　利用0.5%的EMS溶液誘變處理‘陜9B’的種子，通過(guò)苗期大量的除草劑抗性試驗(yàn)篩選，對(duì)具有抗性的植株進(jìn)行移栽培育、收獲種子，再次通過(guò)田間抗除草劑特性鑒定和轉(zhuǎn)基因檢測(cè)，鑒定結(jié)果為非轉(zhuǎn)基因油菜、具有抗除草劑特性(如圖2)。將創(chuàng)制出的抗除草劑種質(zhì)資源，命名為‘陜9BK’。

　　2.3非轉(zhuǎn)基因抗除草劑不育系的選育

　　利用創(chuàng)制的非轉(zhuǎn)基因抗除草劑油菜‘陜9BK’為父本，與母本‘陜9A’雜交，得到F1代不育系，利用‘陜9BK’做回交親本，繼續(xù)與F1代回交轉(zhuǎn)育，經(jīng)過(guò)多代回交育成非轉(zhuǎn)基因抗除草劑油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系‘陜9AK’，選育過(guò)程如圖3。

　　2.4非轉(zhuǎn)基因抗除草劑雜交組合

　　利用非轉(zhuǎn)基因抗除草劑油菜雄性不育系‘陜9AK’與恢復(fù)系‘R1’、‘R2’、‘R3’、‘R4’、‘R5’、‘R6’、‘R7’分別配制雜交組合，在各雜交組合中‘陜9AK×R3’的產(chǎn)量最高，居參試組合第1位，較對(duì)照增產(chǎn)6.95%，其次為‘陜9AK×R6’、‘陜9AK×R1’、‘陜9AK×R4’和‘陜9AK×R2’，‘陜9AK×R5’和‘陜9AK×R7’較對(duì)照減產(chǎn)。試驗(yàn)結(jié)果表明，‘陜9AK×R3’、‘陜9AK×R6’、‘陜9AK×R1’三個(gè)組合的生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，整齊一致，產(chǎn)量高，增產(chǎn)潛力大，抗病抗倒，熟期適中，苗期對(duì)除草劑的抗性強(qiáng)，適宜田間化學(xué)鋤草。

　　3討論

　　3.1EMS誘變濃度在誘變育種中的重要性

　　在作物誘變育種試驗(yàn)中，誘變劑的處理濃度和所誘變作物種子群體的大小直接影響著誘變的效果和誘變目標(biāo)性狀是否出現(xiàn)的關(guān)鍵。合適的誘變處理濃度和處理時(shí)間能夠有效保證群體誘變的可靠性，而且相對(duì)較大的誘變?nèi)后w可保證誘變的飽和度，提高誘變目標(biāo)性狀出現(xiàn)的頻率。本研究中，根據(jù)半致死劑量原則和濃度試驗(yàn)，探索出對(duì)‘陜9B’的最佳誘變濃度為0.5%的EMS溶液，又因油菜種子小，相同質(zhì)量下油菜籽粒數(shù)量多，誘變?nèi)后w相對(duì)較大;通過(guò)分批次處理以及苗期噴施除草劑篩選抗除草劑油菜出現(xiàn)突變體的概率高。

　　3.2非轉(zhuǎn)基因抗除草劑油菜的利用價(jià)值

　　利用已選育的非轉(zhuǎn)基因抗除草劑細(xì)胞質(zhì)雄性不育系‘陜9AK’與已有的優(yōu)良恢復(fù)系配制組合可有效提高選育適宜機(jī)械化栽培管理的油菜品種，如配制的組合‘陜9AK×R3’不但具有抗除草劑特性，而且相對(duì)增產(chǎn)幅度較大。江蘇農(nóng)科院是在國(guó)內(nèi)開展抗除草劑較早的研究單位，浦惠明等在抗磺酰脲類除草劑油菜新品種選育中也取得了較大進(jìn)展[20-26]，利用選育的具有抗性的種質(zhì)資源‘M342’作為輪回親本，與農(nóng)藝性狀優(yōu)良的品系進(jìn)行雜交、回交，轉(zhuǎn)育抗性性狀，目前已經(jīng)選育出一批性狀優(yōu)良具有抗性的親本系和組合，并且育成中國(guó)第一個(gè)抗磺酰脲類除草劑的油菜新品種‘寧R101’，登記編號(hào)為GPD油菜(2018)320256，并且在組合試驗(yàn)中增產(chǎn)顯著[6]。抗除草劑油菜的應(yīng)用，有效提高了田間除草效率，減少了雜草對(duì)油菜生長(zhǎng)的危害，提高土壤營(yíng)養(yǎng)利用效率，保障了油菜正常生長(zhǎng)，加快了機(jī)械化田間管理，提高了油菜種植效益。

　　3.3非轉(zhuǎn)基因抗除草劑油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的選育意義

　　目前，中國(guó)多個(gè)育種單位通過(guò)誘變育種的方式獲得了抗除草劑油菜種質(zhì)資源，而且正在培育抗除草劑油菜雜交種，但這些多數(shù)是對(duì)父本抗除草劑特性的改良，母本為非抗除草劑油菜，雜交種具有抗除草劑特性，盡管在田間化學(xué)鋤草的同時(shí)可以消除母本自交結(jié)實(shí)產(chǎn)生的假雜種，但雜交種制種環(huán)節(jié)沒有簡(jiǎn)化[27-29]。傳統(tǒng)的油菜制種模式為防止父本混入雜交種中需要提前割除父本，投入勞動(dòng)力較多、人工成本高，難以實(shí)現(xiàn)機(jī)械化。非轉(zhuǎn)基因抗除草劑質(zhì)不育的應(yīng)用，可在制種中按照一定比例混合父母本種子，父本為不抗除草劑的恢復(fù)系，混合播種混合收獲，無(wú)需割除父本;大田栽培種，在油菜苗期化學(xué)除草可滅除恢復(fù)系，從而保證田間種植品種純度和整齊度。非轉(zhuǎn)基因抗除草劑質(zhì)不育的利用，使雜種制種程序得到簡(jiǎn)化，即可減少制種用工量，降低制種成本，集約化規(guī)�；�制種，也可解決油菜大田生產(chǎn)機(jī)械化播種用種成本高和有效控制種植密度的難題、實(shí)現(xiàn)機(jī)械化化學(xué)除草田間管理，提高油菜種植效益和農(nóng)民種植的積極性。

　　4結(jié)論

　　本研究以濃度為0.5%的EMS溶液對(duì)‘陜9B’進(jìn)行誘變，獲得具有抗除草劑特性的‘陜9BK’種質(zhì)資源，利用其做輪回親本，選育出具有抗除草劑特性的油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系‘陜9AK’，利用‘陜9AK’做母本配制雜交組合，獲得具有生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，整齊一致，產(chǎn)量高，增產(chǎn)潛力大，抗病抗倒，熟期適中，苗期對(duì)除草劑的抗性強(qiáng)，適宜田間化學(xué)鋤草的雜交組合‘陜9AK×R3’、‘陜9AK×R6’和‘陜9AK×R1’;同時(shí)‘陜9AK’的利用可簡(jiǎn)化油菜制種程序，降低制種成本，提高農(nóng)戶種植效益。

　　《非轉(zhuǎn)基因抗除草劑油菜細(xì)胞質(zhì)雄性探討》來(lái)源：《中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)》，作者：關(guān)周博 董育紅 田建華 王學(xué)芳 張忠鑫 鄭磊

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