20世紀20年代弗萊明博士從青霉菌中發(fā)現(xiàn)青霉素揭開了有目的地利用微生物次生代謝產(chǎn)物的序幕。經(jīng)過80多年的研究，目前已經(jīng)報道的具有生物活性的微生物次生代謝產(chǎn)物達到了20000個以上[1]。其中，一些具有重要的生物活性的微生物天然產(chǎn)物已被開發(fā)成為醫(yī)藥、農(nóng)藥[2-4]，如青霉素、頭孢菌素、他汀類藥物、環(huán)孢菌素A、阿維菌素、Strobilurin類殺菌劑等，在農(nóng)藥及醫(yī)藥中占據(jù)了相當大的比重。微生物天然產(chǎn)物成為新藥開發(fā)的重要源泉。盡管跨國醫(yī)藥企業(yè)在20世紀90年代對天然產(chǎn)物研究與開發(fā)的興趣曾經(jīng)一度下降，但由于組合化學(xué)及高通量篩選并未為其帶來預(yù)期的結(jié)果，這些企業(yè)對天然產(chǎn)物的研究已經(jīng)在復(fù)蘇，天然產(chǎn)物在新藥的研究與開發(fā)中發(fā)揮著重要的作用[5-10]。

　　摘要：微生物天然產(chǎn)物具有獨特的結(jié)構(gòu)多樣性。隨著研究的深入，研究者在進行天然產(chǎn)物篩選時遇到已知化合物的機會加大，有必要在研究的早期對粗提物中的化合物進行早期鑒別及去重復(fù)，以減少不必要的人力、物力及財力的浪費。文章對涉及天然產(chǎn)物早期鑒別及去重復(fù)的方法——薄層層析技術(shù)（TLC）、高效液相色譜（HPLC）-光譜聯(lián)用技術(shù)及天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫在天然產(chǎn)物早期鑒別及去重復(fù)中的應(yīng)用進行綜述，以期為新藥的研究與開發(fā)提供一些借鑒。

　　關(guān)鍵詞：微生物天然產(chǎn)物,早期鑒別,去重復(fù),薄層層析,液相色譜-光譜聯(lián)用技術(shù),數(shù)據(jù)庫

　　據(jù)估計，開發(fā)一種新藥平均要花10～15年的時間，總費用已超過10億美元[11]。在從微生物天然產(chǎn)物中進行藥物篩選研究時，研究者經(jīng)常會碰到已知的化合物或不感興趣的化合物。為了避免不必要的人力、物力及財力的浪費，研究者應(yīng)盡可能在研究的早期對微生物粗提物中的化合物進行初步鑒別，排除其中的已知化合物或重復(fù)的化合物。微生物天然產(chǎn)物早期鑒別及去重復(fù)的一般流程見圖1。以往人們利用紙層析、薄層層析進行微生物天然產(chǎn)物的早期鑒別及去重復(fù)。目前，高效液相色譜（HPLC）已廣泛應(yīng)用于微生物天然產(chǎn)物的早期鑒別及去重復(fù)，與高效液相色譜技術(shù)聯(lián)合使用的現(xiàn)代分析技術(shù)的發(fā)展，使微生物天然產(chǎn)物的早期鑒別及去重復(fù)更為方便。而天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫的建立，則大大簡化了微生物天然產(chǎn)物的早期鑒別與去重復(fù)的過程。本研究對用于微生物天然產(chǎn)物的早期鑒別及去重復(fù)的方法進行總結(jié)，以期對微生物天然藥物的研究與開發(fā)提供一點借鑒。

　　1薄層層析

　　微生物在次生代謝過程中產(chǎn)生復(fù)雜的次生代謝產(chǎn)物。這些復(fù)雜組分的物理化學(xué)性質(zhì)不同，其在不同的溶劑系統(tǒng)中擴散的速度不同。用于微生物次生代謝產(chǎn)物分離的材料包括紙、硅膠、氧化鋁等。事實上，從20世紀40年代開始紙層析技術(shù)就被用于微生物產(chǎn)生的化合物的早期鑒別與去重復(fù)。在20世紀80年代，Zahner等[12]根據(jù)不斷增加的薄層層析（TLC）色譜及顯色劑知識，提出了一個基于薄層層析的微生物天然產(chǎn)物的篩選策略——化學(xué)篩選。微生物提取物經(jīng)薄層硅膠層析展開后，可在紫外及可見光下記錄層析樣品的層析情況；另外，利用多個顯色劑對層析后的樣品進行顯色。通過與數(shù)據(jù)庫中已知化合物進行對比，可初步確定樣品中的化合物是否為數(shù)據(jù)庫中的化合物。該方法在德國漢高研究所（HKI）和HOECHST制藥公司得到運用，利用該方法對8000株微生物進行了篩選，分離到259個化合物，其中129個化合物是新結(jié)構(gòu)化合物。新化合物分離的比率達到50%[13]。云南大學(xué)微生物研究所李銘剛等[14，15]通過與HKI合作，利用其TLC數(shù)據(jù)庫對一株嗜堿放線菌的次生代謝產(chǎn)物進行了早期鑒別，從中分離到了兩個活性化合物。Filtenborg等[16，17]也采用TLC方法，結(jié)合可見光、紫外線及顯色劑，對真菌產(chǎn)生的毒素進行了篩選。但是該方法的最大缺陷是分辨率不高、自動化水平不高，特別是對一些未知化合物缺乏有效的鑒別手段，對化合物的快速鑒別依賴于數(shù)據(jù)庫中化合物的數(shù)量。

　　2液相色譜（LC）技術(shù)與光譜技術(shù)聯(lián)用

　　20世紀60年代末至70年代初，科克蘭（Kirkland）等人開發(fā)了世界上第一臺商業(yè)高效液相色譜儀，開啟了HPLC時代[18]。隨著技術(shù)的發(fā)展，如柱料的改進、高壓泵的應(yīng)用，HPLC技術(shù)的分離效果提高迅速，而與計算機聯(lián)用則大大提升了高效液相色譜的自動化程度。LC技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物活性物質(zhì)的分離、純化。將具高分離性能的LC技術(shù)與能夠獲取豐富化學(xué)結(jié)構(gòu)信息的光譜技術(shù)相結(jié)合，通過一次或少數(shù)幾次分析即可全面地獲得整個微生物粗提物的化學(xué)組成、含量及結(jié)構(gòu)等信息，在研究的早期即鑒別或鑒定出化合物的結(jié)構(gòu)及預(yù)測出新化合物的存在，達到對生物活性物質(zhì)進行快速篩選的目的，大大促進了微生物來源的有生物活性的新化合物的發(fā)現(xiàn)。

　　2.1與紫外光譜聯(lián)用（LC-UV）

　　微生物粗提取物通過色譜柱分離后，含有某一特定化合物的流動相在通過光電二極管陣列檢測器時，計算機的色譜工作站可獲得這一化合物的紫外光譜圖。色譜工作站可將獲得的紫外圖譜存儲在計算機中，并可與建立的已知或標準化合物的紫外圖譜庫進行比對，快速確定該化合物是否為已知化合物。此外，紫外光譜還可提供一些被檢測的化合物的結(jié)構(gòu)信息。液相與紫外光譜技術(shù)的聯(lián)用，已廣泛應(yīng)用于微生物天然產(chǎn)物的化學(xué)篩選，研究者利用這一手段結(jié)合生物活性篩選，從微生物中發(fā)現(xiàn)了一些新的生物活性化合物[19-31]。德國Goettingen大學(xué)的Laatsch教授研究小組建立了天然產(chǎn)物標樣及分離的天然活性化合物的紫外圖譜庫，用于微生物天然產(chǎn)物的早期鑒別與排重。受到資源的制約，這種自建的數(shù)據(jù)庫中化合物的數(shù)量相對較小。丹麥理工大學(xué)的研究者建立了自動比較LC所得到的化合物紫外圖譜的方法，并利用此方法發(fā)現(xiàn)了兩個新的化合物[32，33]。隨著LC技術(shù)的發(fā)展，超高效液相色譜（UPLC）在微生物天然產(chǎn)物分析中的應(yīng)用越來越廣泛。利用UPLC與光電二極管陣列檢測器聯(lián)用，可更為迅速地進行微生物粗提取物中化合物組成的分析[34]。光電二極管陣列檢測器的缺點在于不能檢測不具有發(fā)色基團的微生物天然產(chǎn)物。此外，由于可供分析的已知化合物的數(shù)量有限，采用此種方法能夠剔除的僅為已有的化合物。2.2與質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）

　　質(zhì)譜儀具有靈敏度高的特點，通�？蓹z測到納克乃至皮克級的化合物，可獲得被檢測化合物的分子量與結(jié)構(gòu)信息。高分辨質(zhì)譜（MS）還可確定被分析的化合物的分子式。與LC聯(lián)用的質(zhì)譜儀包括：單四極桿、串聯(lián)四極桿、離子阱及飛行時間質(zhì)譜（高分辨）儀等。Fredenhagen等[35]建立了以LC-離子阱質(zhì)譜儀聯(lián)用來快速有效地鑒定微生物提取物中原來已分離鑒定的化合物的方法。采用LC-MS對微生物發(fā)酵提取物中的化合物進行分析，通過與該數(shù)據(jù)庫中已知天然產(chǎn)物的母離子MS數(shù)據(jù)進行比較，基本上可以確定微生物發(fā)酵提取物中是否有新的化合物。Si等[36]采用LC/ESI-MS/MS對來源于藤黃灰鏈霉菌發(fā)酵液的次生代謝產(chǎn)物進行化學(xué)篩選，鑒定出了46種異戊他定系列氨基寡糖類成分，其中41種為新化合物。在該LC-MS分析結(jié)果的指導(dǎo)下分離得到了其中11個化合物的單體，經(jīng)核磁共振（NMR）分析等手段確認了它們的結(jié)構(gòu)，均與LC-MS提示的結(jié)構(gòu)相一致。Feistner[37]采用液質(zhì)聯(lián)用對Erwinia屬細菌的代謝物組成進行了分析。Nielson等[38]利用液相色譜-紫外與高分辨飛行時間質(zhì)譜，建立了一個快速有效的鑒別真菌次生代謝產(chǎn)物及其分子組成的方法。Kim等[39]利用液質(zhì)聯(lián)用對4株Myxococcusxanthus的次生代謝產(chǎn)物進行了鑒別，從中發(fā)現(xiàn)了一個新化合物MyxalamidK。而利用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用，可以更加快速地對微生物提取物中的化合物進行鑒別。Berrue等[40]利用UPLC-MS建立了Erythropodiumcaribaeorum珊瑚的主要代謝產(chǎn)物的UPLC-MS數(shù)據(jù)庫。利用UPLC-MS，他們從該珊瑚的附生微生物中快速篩選到了產(chǎn)生目標化合物的微生物菌株。Ito等[41]利用UPLC-MS對16025個微生物提取物進行了分析，利用ACDIntelliXtract軟件對得到的液質(zhì)分析數(shù)據(jù)進行了處理，從提取物中發(fā)現(xiàn)了38000多個不同的化合物峰。而將這些化合物的相關(guān)信息整合，形成了一個數(shù)據(jù)庫[41]。德國的Goettingen大學(xué)建立了1000多個微生物天然產(chǎn)物的ESIMS/MS數(shù)據(jù)庫，用于化合物的早期鑒別[42]。還有的研究者利用電噴霧質(zhì)譜儀直接進樣，對微生物提取物的化合物組成進行分析[43-45]。

　　由于質(zhì)譜儀本身的局限性，其所得到的結(jié)構(gòu)信息不足以解決化合物的鑒定問題；另外，不同的化合物對離子化條件要求不同；與液相聯(lián)用時對流動相的要求較高，不宜使用不揮發(fā)性緩沖鹽。因此，單純依賴LC-MS聯(lián)用仍不能解決微生物天然產(chǎn)物的早期鑒別與去重復(fù)等問題。

　　2.3與核磁共振譜聯(lián)用（LC-NMR）

　　NMR技術(shù)是用于結(jié)構(gòu)鑒定的最為有效的手段。將NMR與LC結(jié)合起來，利用LC對化合物的高效分離，對目標化合物的結(jié)構(gòu)進行鑒定。LC-NMR的操作模式有3種：連續(xù)流（Onflow）、停流（Stoppedflow）及峰貯存（Loop-storage）[46，47]。NMR的靈敏度相對質(zhì)譜來說較低，通常最低只能檢測微克級的樣品。但是隨著技術(shù)的進步，在LC與NMR聯(lián)用的硬件及軟件方面取得了顯著進展，如核磁共振儀的磁場強度達到900A/m，專為聯(lián)用設(shè)計的流通探頭、毛細管探頭、超低溫探頭等，可提升檢測的靈敏度，在某些模式下可以檢測微克以下的樣品[42，48，49]。NMR可以獲得所分析化合物的部分甚至是全部結(jié)構(gòu)信息，可在研究的早期確定所研究的化合物是否為已知化合物或初步確定新化合物的結(jié)構(gòu)。該技術(shù)目前已經(jīng)應(yīng)用于微生物天然產(chǎn)物粗提物的早期鑒別與去重復(fù)[42，48，50，51]。該方法還存在一些不足，主要表現(xiàn)在：①靈敏度仍然較低；②對復(fù)雜的樣品分析存在難度（主要是色譜分離）；③溶劑峰的影響。這些都還有賴于儀器技術(shù)進步來解決。

　　2.4液相與多種光譜技術(shù)聯(lián)用

　　將高效液相色譜與多種光譜技術(shù)聯(lián)用，可同時獲得所分析化合物較為完整的各種信息。不同的光譜技術(shù)的聯(lián)合運用，可彌補LC與單一光譜技術(shù)聯(lián)用所存在的缺陷，獲得微生物粗提物中化合物較為完全的結(jié)構(gòu)信息，結(jié)合數(shù)據(jù)庫檢索，可快速確認目標化合物是否為已知化合物或新化合物[52，53]。Lang等[42，48]建立了液相與多種光譜技術(shù)聯(lián)用的真菌提取物中已知化合物去重復(fù)的方法。對具有抗細菌、抗真菌或細胞毒性的真菌或細菌提取物，先采取LC-UV分析，并結(jié)合生物測定，對得到的活性峰對應(yīng)的紫外光譜和保留時間與建立的已知化合物紫外光譜數(shù)據(jù)庫進行比較。如果未發(fā)現(xiàn)匹配的化合物，則將得到的質(zhì)譜和（或）紫外信息輸入到MarinLit或Antibase等數(shù)據(jù)庫中進行查詢。對仍然不匹配的化合物，則將根據(jù)1HNMR圖譜解析得到的部分結(jié)構(gòu)信息輸入到Anti/Marin數(shù)據(jù)庫中進行檢索，可快速確定化合物是否為已知化合物。利用該方法，他們從一株內(nèi)生真菌中鑒定出PhomosineA、PhomosineC及其他的Phomosine衍生物。

　　3天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫在早期鑒別及去重復(fù)中的應(yīng)用

　　一旦對微生物粗提物進行了各種分析，并獲得了一些與其結(jié)構(gòu)相關(guān)的信息后，如何快速有效地確認其是否為已知化合物是研究者所要解決的首要問題。利用這些數(shù)據(jù)與信息，若直接從文獻（論文及專利）中查找則費時費力。為了快速地鑒別微生物粗提物中的化合物，可利用一些公共數(shù)據(jù)庫，如SciFinder、ChemBank、ChemID、PubChem等[54]。但是這些公眾數(shù)據(jù)庫只能提供化合物的名稱、結(jié)構(gòu)、化學(xué)特性、用途、生物學(xué)活性等。這些在線的公眾數(shù)據(jù)庫在確定一個已明確結(jié)構(gòu)的化合物是否為新化合物時非常方便。但是這些數(shù)據(jù)與通過儀器分析所得到的數(shù)據(jù)不能很好地銜接。

　　目前，用于微生物天然產(chǎn)物早期鑒別與去重復(fù)的數(shù)據(jù)庫主要是一些專業(yè)的商業(yè)數(shù)據(jù)庫，包括TheDictionaryofNaturalProducts、Antibase2012、BerdyBioactiveNaturalProductsDatabase、UMEZAWADB、MarinLit等。此外，商業(yè)化合物數(shù)據(jù)庫，如CAS、Reaxys也包含了大量的天然產(chǎn)物的數(shù)據(jù)[54，55]。由Chapman&Hall開發(fā)的DictionaryofNaturalProducts可提供DVD版及網(wǎng)絡(luò)版，其最新版中包含了23萬多個天然產(chǎn)物的化學(xué)、物理及結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，如化合物的精確名稱及通用名、分子式、分子量及元素組成、化學(xué)結(jié)構(gòu)、紫外及化合物來源、化合物的物理性質(zhì)（如熔點、沸點、旋光性、生物活性及毒性等），基本包含了BerdyBioactiveNaturalProductsDatabase的信息。該數(shù)據(jù)庫每半年更新一次[56]。Antibase數(shù)據(jù)庫由德國Gottingen大學(xué)Laatsch教授領(lǐng)導(dǎo)的團隊開發(fā)，Wiley出版集團發(fā)行，為軟件版。該數(shù)據(jù)庫包含了30000多個微生物來源的產(chǎn)物，包括了微生物天然產(chǎn)物的分子式、分子量、元素組成、理化性質(zhì)、光譜數(shù)據(jù)、生物活性數(shù)據(jù)及來源（含相關(guān)的文獻），并能夠提供結(jié)構(gòu)查詢。該數(shù)據(jù)庫為每年更新一次[57]。日本在微生物天然產(chǎn)物的研究與開發(fā)方面開展了大量的工作，也開發(fā)了一些專門針對微生物天然產(chǎn)物的數(shù)據(jù)庫。日本北里大學(xué)北里研究所微生物化學(xué)實驗室開發(fā)的新北里化學(xué)數(shù)據(jù)庫，包括了16000種微生物次生代謝產(chǎn)物，該數(shù)據(jù)庫可與DOS兼容，包含了化合物的物理化學(xué)性質(zhì)，但是沒有化學(xué)結(jié)構(gòu)[58]。日本的BioscienceAssociatesTM開發(fā)的基于MicrosoftOfficeAcess的UMEZAWADB，其前身為ActFund，包括了16000多個微生物天然產(chǎn)物的物理、化學(xué)及生物學(xué)特性，可采用紫外、分子量及分子式進行查詢[59]。日本理化研究所（RIKEN）開發(fā)了一個微生物天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫，包括16000多個化合物，可提供化合物名稱、結(jié)構(gòu)、分子式、分子量、產(chǎn)生菌、生物活性及化合物的基本特性等[60]。MarinLit由新西蘭Canterbury大學(xué)開發(fā)并維護，該數(shù)據(jù)庫收集了約22000個海洋天然產(chǎn)物的相關(guān)信息，其中包含了一部分海洋微生物天然產(chǎn)物的信息[42]。該大學(xué)與德國Goettingen大學(xué)合作，將MarinLit數(shù)據(jù)庫與Antibase數(shù)據(jù)庫整合，形成了一個包括50000多個化合物的數(shù)據(jù)庫AntiMarin。該數(shù)據(jù)庫中可提供1HNMR圖譜所推導(dǎo)的結(jié)構(gòu)信息的查詢，每年更新一次[42]。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物所于20世紀80年代開始，逐步建立了基于Foxbase的微生物產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫MPMS。2000年后通過與上海創(chuàng)騰科技合作，利用MDL公司的ISIS化學(xué)信息管理系統(tǒng)作為開發(fā)平臺，對原有的數(shù)據(jù)庫進行了更新，開發(fā)了新一代的微生物天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫（MNPD）。該數(shù)據(jù)庫收集了微生物天然產(chǎn)物共15000多個，主要包括微生物天然產(chǎn)物的名稱、分子式、分子量、結(jié)構(gòu)類型、CAS登記號、顏色、晶型、熔點、旋光度、溶解性、紫外和紅外特征吸收峰等重要理化性質(zhì)、微生物天然產(chǎn)物的產(chǎn)生菌、制備方法及生物活性、相關(guān)原始參考文獻及專利信息[61]。還有研究者根據(jù)研究所得到的數(shù)據(jù)自主進行天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫的開發(fā)。Lopez-Perez等[62]開發(fā)了一個包含6000多個天然產(chǎn)物的13C圖譜的數(shù)據(jù)庫NAPROC-13，可用于已知天然產(chǎn)物的快速結(jié)構(gòu)鑒定，也可為未知化合物的結(jié)構(gòu)解析提供幫助。4結(jié)語

　　微生物天然產(chǎn)物仍將在新藥研究與開發(fā)中發(fā)揮重要的作用。而在研究的早期對已知化合物進行有效鑒別與去重復(fù)是發(fā)現(xiàn)具有新結(jié)構(gòu)的活性化合物的關(guān)鍵。結(jié)合活性篩選，運用薄層層析、液相-光譜聯(lián)用，在研究的早期獲得微生物粗提物中的活性化合物的相關(guān)信息，并通過數(shù)據(jù)庫比對，可快速進行已知化合物的鑒別與去重復(fù)，并加速新活性化合物的結(jié)構(gòu)解析。但是所有的技術(shù)都有其局限性，前文談到了各種技術(shù)都存在這樣或那樣的問題，任何單一的技術(shù)都不可能完全解決微生物粗提物中所有的化合物的早期鑒別與去重復(fù)，特別是那些極微量的化合物。而針對這些技術(shù)的改進，將極大地促進具有新結(jié)構(gòu)的微生物源生物活性天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)，從而推動藥物研究開發(fā)與新藥創(chuàng)制。

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