摘要：牛初乳中的免疫球蛋白是動(dòng)物體內(nèi)免疫系統(tǒng)最為關(guān)鍵的物質(zhì)之一,有抑制毒素和病原微生物等功能。國(guó)內(nèi)外在提取活性免疫球蛋白的方法上均有大量的研究,依據(jù)不同用途選擇提取純化方法,并將不同方法進(jìn)行組合使用,可以收到良好的制取效果。

關(guān)鍵詞：牛初乳 IgG 分離 提純

1.免疫球蛋白G(IgG)生化特性及生理功能

牛初乳IgG免疫活性的變化主要受消化道內(nèi)pH值和各種蛋白酶的影響。張和平等(1997)研究IgG在體外的消化特性時(shí)發(fā)現(xiàn)，在pH 2.0及存在胃蛋白酶時(shí)IgG損失較大，在pH 4.0及存在胃蛋白酶時(shí)IgG損失較小，在pH 7.0及存在胰蛋白酶時(shí)IgG則能夠很好地保持免疫活性。在胃腸道中，牛初乳IgG則能夠有效地抵抗酸和酶的降解，保持其免疫活性。這是因?yàn)榕３跞楹�有能夠抑制蛋白酶活力的某些糖蛋白和能夠有效保護(hù)活性因子免受蛋白酶破壞的其他酶抑制劑。IgG等抗體物質(zhì)具有特殊的天然結(jié)構(gòu)，許多研究證實(shí)IgG是乳清蛋白中對(duì)蛋白酶降解具有較高抗性的組分，這是生物進(jìn)化的結(jié)果。

2.牛初乳IgG的分離提純方法

2.1 膜分離技術(shù)的應(yīng)用

膜分離技術(shù)作為生化分離技術(shù)的一項(xiàng)主要內(nèi)容，已被世界許多國(guó)家的乳品行業(yè)采用�，F(xiàn)已應(yīng)用到乳品行業(yè)的膜分離技術(shù)有超濾(uF)、反滲透(RO)和納濾(NF)。膜技術(shù)在乳清蛋白回收、乳糖的分離、乳清脫鹽、牛乳濃縮等方面都取得了很大成果和經(jīng)濟(jì)效益。用膜分離技術(shù)來(lái)分離牛初乳中的IgG可避免因酸沉淀、受熱對(duì)IgG分子結(jié)構(gòu)、活性的破壞，得到高效的免疫球蛋白。

張小平研究了超濾分離牛初乳乳清中IgG的方法，測(cè)定不同超濾溫度和壓力條件下IgG含量和活性的變化情況。結(jié)果表明：通過(guò)超濾可將乳清中IgG含量提高一倍左右;超濾壓力增加，IgG含量相應(yīng)增加，IgG活性基本不變。在壓力0.08 MPa時(shí)，IgG含量為45.98mg/mL，活性未變，仍為1024;超濾溫度增加，初乳中的IgG含量先有較小增加然后減少，IgG活性則下降。在超濾溫度40度時(shí)，IgG含量最高，達(dá)到46.85 mg/mL，IgG活性未有變化。采取單一的超濾方式分離提純工藝所得目標(biāo)蛋白純度往往很低。

2.2 離子交換色譜的應(yīng)用

脫脂牛初乳用濃度為6 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)其pH至4.0，以5 ooo r/min離心分離20 min除去酪蛋白制得乳清，緩慢滴加濃度為1 mol/L的氫氧化鈉回調(diào)pH至6.8;處理后的乳清經(jīng)截留相對(duì)分子質(zhì)量為50 ooo的組分并超濾稀釋后，再經(jīng)過(guò)陰陽(yáng)離子交換串聯(lián)色譜，免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)吸附于DEAE Sepharose Fast Flow;陰離子交換柱用c(NaCI)=17 mmoVL、51 mmol/L的水溶液階躍洗脫，得到色譜純度為95%的IgG產(chǎn)品。

王曉工等采取二甲基十二烷基芐基溴化銨(Dimethyllaurbenzylammonium，簡(jiǎn)稱(chēng)DMLBAB)作為預(yù)處理介質(zhì)，采用離子交換色譜和凝膠過(guò)濾色譜聯(lián)合分離純化牛初乳中的IgG，和IgG2。最終實(shí)際取得實(shí)驗(yàn)室制備規(guī)模的目標(biāo)物，其含量最高為：IgG1總量在85%～90%之間，其中IgG2含量占90%。

但上述分離一般只針對(duì)牛初乳中單一活性蛋白進(jìn)行提純，所用鹽析與凝膠過(guò)濾分離單元操作，大大限制了分離工藝的工業(yè)化;范麗娟、潘道東采用硫酸銨一次性鹽DEAE-SepharoseFF離子交換層析和SephacrylS-200凝膠過(guò)濾層析法,分離純化免疫初乳中的IgG,并采SDS-PAGE電泳、單向火箭免疫電泳及試管凝集法對(duì)IgG分離物進(jìn)行了定性定量檢測(cè),結(jié)果表明所得IgG純度高,活性大。2.3高效液相色譜法

高效液相色譜法(High Performance LiquidChromatograph，HPLC)利用混合物中各物質(zhì)在兩相間分配系數(shù)的差別，當(dāng)溶質(zhì)在兩相間做相對(duì)移動(dòng)時(shí)，各物質(zhì)在兩相間進(jìn)行多次分配，從而使各組分得到分離。HPLC法具有分離效率高、應(yīng)用范圍廣、分析速度快、樣品用量少而且靈敏度高、分離和測(cè)定一次完成、易于自動(dòng)化，可在工業(yè)流程中使用等優(yōu)點(diǎn)。

熊勇華等運(yùn)用凝膠色譜柱(TSK—G3000sW))建立了牛初乳中IgG的高效液相色譜檢測(cè)法。流動(dòng)相為0.1 mol/LPB +0.1 mol/L Na2SO4+0.05% NaN3(pH6.7);流速1.0 mL/min;UV(280 nm)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)得出牛初乳中IgG含量在40-70 mg/mL之間，3d后初乳IgG含量總量下降很快，第7d IgG含量平均在1- mg/mL之間;其線性相關(guān)系數(shù)R=0.9915，回收率平均大于98.5%。

2.3 高效親和色譜法

楊祖英等 采用高效親和色譜柱Pharmacia HI-TrapProtein G柱，在pH6.5磷酸鹽緩沖液條件下將樣品中的IgG與配基連接，在pH2.5的鹽酸甘氨酸條件下洗脫IgG進(jìn)行測(cè)定。PDAD(280 nm)檢測(cè);流動(dòng)相A液(pH6.5 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液)和B液(pH2.5 0.05 mol/L的鹽酸甘氨酸緩沖液)，并進(jìn)行梯度洗脫。實(shí)驗(yàn)得出其線性相關(guān)系數(shù)為0.9960，最低檢出濃度為0.5 mg/g，回收率為88%-102%。李莉在與楊祖英實(shí)驗(yàn)中所用的色譜柱、檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相相同的情況下，得出IgG保留時(shí)間為11.7 min，平均回收率為93.16%，批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2%

件下離心20-30min,得較高純度的IgG。

結(jié)束語(yǔ)：

綜上所述，進(jìn)行牛初乳IgG的分離提純方法有很多，針對(duì)牛初乳理化性質(zhì)進(jìn)行研究，每一種方法都有它的優(yōu)點(diǎn)和弊端，但在科研和時(shí)間生產(chǎn)實(shí)踐中都得到了應(yīng)用，并不斷的探索和研究，使得牛初乳IgG的分離提純方法研究更加深入和廣泛，其分離提純方法和體系也更加完善，相信在今后的科研中會(huì)有更加先進(jìn)的方法被研發(fā)出來(lái)，讓牛初乳IgG的分離提純更加科學(xué)和完善。

參考文獻(xiàn)：

[1]于立芹，龐廣昌,牛初乳中生物活性成分的研究進(jìn)展[J]，食品科學(xué)，2007，28(9):604.

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