植物對病原物的抗性是一個復雜的生命現(xiàn)象，植物通過其細胞預存的和誘導形成的防衛(wèi)能力產(chǎn)生抗病能力[1-2]。外界植物病原物如細菌、真菌、病毒等均能誘導植物產(chǎn)生主動防御反應。接下來小編簡單介紹一篇優(yōu)秀微生物煙葉論文。

　　在煙草中，國內(nèi)外研究者將微生物(如細菌、真菌等)應用于煙葉，以提高煙葉的抗性和品質。Koller等[3]在煙葉中接種微生物以增加香氣和改善吸味。English等[4]從發(fā)酵煙葉上分離出嗜熱細菌，并將這些菌株用于煙葉，可產(chǎn)生香氣。趙銘欽等[5]報道了微生物發(fā)酵增質劑可提高卷煙香氣。馬林等[6]用微生物和酶噴施煙葉可降解煙葉中的蛋白質含量，并減少有害氣相物質和焦油生成量。謝和等[7]研究發(fā)現(xiàn)對煙葉添加微生物，可減少煙葉的青雜氣，降低刺激性。汪長國等[8]從煙田土壤中分離篩選出一種芽孢桿菌并制備成微生物制劑(MP制劑)，噴施采收前的煙葉能改變煙葉中重要香味成分和蛋白質含量。在此基礎上趙敏等[9]研究發(fā)現(xiàn)，噴施MP制劑的煙葉組織蛋白酶B基因的表達量高于噴施水的煙葉中組織蛋白酶B基因的表達量，并推測煙葉中組織蛋白酶B基因具有抗菌功能。近年來，蛋白質組學作為后基因組研究中最主要的部分，研究途徑之一就是篩選一些目標間的差異蛋白質譜，揭示細胞生理和病理狀態(tài)的進程與本質、對外界環(huán)境刺激的反應途徑以及細胞調(diào)控機制，同時研究分析某些關鍵蛋白的功能[10]。本試驗利用差異蛋白質組學的研究方法進一步探討微生物與煙葉間的關系，采用雙向電泳技術結合基質輔助激光解析串聯(lián)飛行時間質譜(MALDITOF/TOFMS)，鑒定噴施MP制劑和水的煙葉的差異蛋白，旨在揭示利用MP制劑提高煙葉抗性的分子機制。

　　1材料與方法

　　1.1材料與試劑

　　1.1.1材料噴施煙葉的微生物制劑為巨大芽孢桿菌(MP制劑)[8]，從煙田土壤中分離、篩選。噴施煙葉為實驗室智能光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)60d的煙草無菌苗，品種為K326。

　　1.1.2試劑與儀器N，N-甲叉雙丙烯酰胺(Bis-acrylamide)、丙烯酰胺(Acrylamide)、Tris、硝酸銀購于BBI公司，十二烷基硫酸鈉(SDS)、尿素、過硫酸銨、甘氨酸、CHAPS、硫代硫酸鈉、高鐵氯化鉀購于Amresco公司，溴酚藍、87%(質量分數(shù))甘油、DDT、碘乙酰胺、瓊脂糖、四甲基二乙胺(Temed)、IPG膠條(pH3-10，膠條長13cm)、IPGbuffer購于GE公司，TBPReducingAgent購于Bio-RAD公司，甲醇、冰醋酸購于重慶化學試劑廠，乙腈購于Honeywell公司，三氟乙酸、胰蛋白酶、α-氰基-4-羥基肉桂酸購于Sigma公司，碳酸氫銨、甲醛、無水碳酸鈉購于上海生物工程公司，蛋白分子marker購于Fermantas公司。HoeferSE600Ruby型垂直電泳儀、EttanIPGphorIII型等電聚焦儀、ImagescannerIII掃描儀(GE公司)，4700MALDITOF/TOF質譜分析儀(ABI公司)，Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)，DataExplorerV4.5肽質量指紋圖譜分析軟件，Mascot軟件。

　　1.2方法

　　1.2.1微生物MP制劑的準備及噴施將MP制劑培養(yǎng)至濃度108CFU/mL，收集部分菌液，剩余菌液低速離心收集菌體和上清液。將制劑菌體和水(對照)2種不同處理(各50mL)分別噴施到培養(yǎng)60d的煙草無菌苗葉面和葉背，噴施后9d取樣并在液氮中保存。

　　1.2.2蛋白質的提取利用三氯乙酸-丙酮沉淀法提取煙葉的蛋白質。先在液氮中研碎煙葉，將粉末懸浮于含DTT(0.2%)的10%三氯醋酸的丙酮溶液中，-20℃沉淀過夜。35000g(6℃)離心30min后，將沉淀重懸于含0.2%DTT的預冷丙酮中，-20℃放置1h，35000g(6℃)離心30min。在通風櫥中讓丙酮充分揮發(fā)，得到干燥的沉淀。在裂解液中重新溶解沉淀，40000g(15℃)離心1h。用Bradford法測定上清液的蛋白濃度，分裝后置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

　　1.2.3蛋白質雙向電泳第1向等電聚焦采用IPGphorIII等電聚焦儀，選擇pH3~10，長13cm的IPG膠條，按照IPGphorIII等電聚焦系統(tǒng)的方法進行實驗操作。樣品在水化液中水化。吸取250μL樣品(含100μg蛋白)的水化液放入標準型膠條槽中，放置好IPG膠條后在膠條上覆蓋適量ImmobilineDryStrip覆蓋油。設置IPGphorIII儀器運行參數(shù)，等點聚焦的程序為：50V水化11h，100V1h，200V1h，500V30min，1000V30min，3000V30min，5000V30min，8000V80000Vhr。各膠條最大電流為50μA。聚焦完畢后采用兩步平衡法進行膠條平衡。第一步平衡首先取出含樣品的IPG膠條，將其放入裝有平衡液中平衡15min。第二步平衡時的平衡液中用1.25%碘乙酰胺代替DTT。最后，將IPG膠條在1倍電泳緩沖液中潤洗并瀝干，然后放入第2向SDS-PAGE膠中電泳。電泳結束后采用硝酸銀染色，并利用ImagescannerIII掃描儀掃描，蛋白斑點的匹配分析利用2-DE圖像分析軟件ImageMasterTM2DPlatinum6.0。為了提高實驗的可靠性，雙向電泳實驗重復3次。

　　1.2.4質譜鑒定及數(shù)據(jù)庫查詢將噴施MP制劑與水的煙葉蛋白質雙向電泳結果中的差異蛋白點挖出后放置于準備好的離心管中，加入脫色液(臨用前30mmol/L高鐵氯化鉀和100mmol/L硫代硫酸鈉以1∶1的比例混合)以脫掉膠的顏色。隨后用milli-Q水清洗3次，并用適量100%乙腈浸泡，晾干后加入適量胰蛋白酶(濃度為10μg/mL)，放置37℃恒溫箱中消化20h。酶解后將酶液轉入另一套已準備好的管子中，用約25μL的50%ACN/5%TFA浸泡30～60min后，將溶液吸出與酶液合并，隨后真空濃縮后用3μL50%ACN/5%TFA重新溶解樣品，將樣品送入4700MALDITOF/TOF質譜分析儀進行質譜鑒定，并利用Mascot軟件和NCBI現(xiàn)有煙草蛋白質數(shù)據(jù)進行本地化建庫檢索分析。

　　2結果與分析

　　2.1雙向電泳凝膠圖譜利用雙向電泳技術分析噴施MP制劑和水作為對照煙葉中的差異蛋白。采用13cm，pH3~10的膠條對差異蛋白進行分析，經(jīng)硝酸銀染色后得到的雙向電泳圖譜如圖1。在相同條件下，對同一處理的煙葉提取的蛋白進行了3次重復實驗。電泳圖顯示，兩種不同處理煙葉的蛋白點的分布較為相似，聚焦效果比較理想，圖譜的染色背景淺，蛋白點的形狀較為規(guī)則，重復性較好。通過圖像掃描和分析，可以檢測到(200±10)個較為明顯的蛋白點，主要分布在pH3~8區(qū)域，分子量在15~60kD之間。

　　2.2煙葉的差異蛋白點分析在噴施MP制劑和水的煙葉蛋白質的雙向電泳圖譜中，有些蛋白點存在差異，其中選擇分辨清楚的差異蛋白點6個，見圖2。圖2中蛋白點1在噴施水的煙葉中的表達量明顯高于噴施MP制劑的煙葉;蛋白點2出現(xiàn)在噴施MP制劑的煙葉圖譜中，而在噴施水的煙葉中并沒有表達;而蛋白點3，4，5，6在噴施MP制劑的煙葉中表達量明顯高于噴施水的煙葉，這些差異蛋白可能對煙葉噴施MP制劑后起到重要作用。為鑒定差異蛋白點的性質，對這6個差異蛋白點進行MALDITOF/TOF分析。鑒定結果顯示，蛋白點1，2未鑒定出結果，蛋白點3，4，5，6分別為煙草酸性幾丁質酶PR-P(AcidicchitinasePR-PinNicotianatabacum)、煙草幾丁質酶前體(EndochitinaseprecursorinNicotianatabacum)、內(nèi)切幾丁質酶A前體(EndochitinaseAprecursor)、逆滲透蛋白(Osmotin)。這些鑒定蛋白的NCBI編號、等電點、理論分子質量和覆蓋度見表1。

　　3小結與討論

　　幾丁質酶(EC3.2.1.14)是降解幾丁質的糖苷酶。研究發(fā)現(xiàn)，幾丁質酶是主要的植物病程相關蛋白(PR蛋白)之一，與植物的抗病性密切相關。根據(jù)幾丁質酶前體的氨基酸序列，可將幾丁質酶分為5類[11-12]，其中第三類幾丁質酶為兼具幾丁質酶和溶菌酶的雙功能酶，可分解細菌細胞壁的肽聚糖，甚至還可能催化轉葡糖基反應，因而可對細菌產(chǎn)生毒害作用。同時幾丁質酶還對細胞壁中含有幾丁質的真菌有抑制作用，與植物的防疫保護機制有密切關系[13-14]。本試驗利用芽孢桿菌制備而成的MP制劑以及水作為對照噴施煙葉后測定煙葉的差異蛋白及其性質。鑒定的差異蛋白之一為幾丁質酶。結合幾丁質酶在植物中的性質，推測煙葉在受到MP制劑處理后啟動了應急機制，促使其幾丁質酶表達量增加，進而促進MP制劑中芽孢桿菌細胞壁的肽聚糖分解，同時增強了對真菌的抗性。逆滲透蛋白(Osmotin)是一類植物蛋白，屬于植物抵御蛋白PR-5蛋白家族。該蛋白在轉基因植物中的表達能抑制真菌病原體數(shù)量的增長[15-17]。在煙草上，Osmotin最早由Singh等[18]從煙草細胞培養(yǎng)物中鑒定出，為豐度蛋白。隨后的研究也發(fā)現(xiàn)該蛋白具有抵抗真菌的活性[19]。本試驗通過雙向電泳和串聯(lián)質譜鑒定發(fā)現(xiàn)在對煙葉噴施MP制劑后Osmotin的表達量高于噴施水的煙葉。結合Osmotin在植物中的抗真菌功能，推測在噴施MP制劑后煙葉能有效增加抵御外源真菌的能力，進而促使煙葉抗病性的增強。本實驗鑒定出的幾丁質酶和逆滲透蛋白均與煙草抗性相關。煙葉噴施MP制劑后，幾丁質酶和逆滲透蛋白發(fā)揮了作用，促使煙葉抵御外源病菌入侵。但MP制劑提高煙葉抗性進而改善煙葉品質的內(nèi)在機制尚有待進一步研究。

　　閱讀期刊：《中國煙草學報》

　　《中國煙草學報》創(chuàng)刊于1992年，是中國科協(xié)主管，中國煙草學會主辦的覆蓋煙草工業(yè)、農(nóng)業(yè)、經(jīng)濟及相關領域的學術理論期刊。本刊以活躍學術氣氛、傳播科學思想、促進理論思維、服務中心工作為辦刊宗旨。雜志適合于煙草企事業(yè)單位的科技工作者、經(jīng)營管理者、相關專業(yè)科技人員，大專院校相關專業(yè)師生等。

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