在自然微生態(tài)系統(tǒng)中，微生物群落在各項(xiàng)物質(zhì)循環(huán)與能量循環(huán)中發(fā)揮著重要作用。龐大的微生物數(shù)量及其錯(cuò)綜復(fù)雜的功能網(wǎng)絡(luò)使得微生物資源的研究和有效利用具有很大的挑戰(zhàn)性。在實(shí)驗(yàn)室條件中很難模擬微生物群落的自然生境，無法為微生物群落提供理想的生長(zhǎng)環(huán)境，傳統(tǒng)培養(yǎng)富集技術(shù)只能提供有限的微生物群落信息，而且實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)。分子生物學(xué)技術(shù)則直接檢測(cè)微生物的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)――核酸，極大地減輕了對(duì)培養(yǎng)方法的依賴，由此顯著促進(jìn)了自然生境中微生物的監(jiān)測(cè)和定性描述。

　　摘要：功能基因芯片是一項(xiàng)以編碼各種微生物生理功能的基因?yàn)樘结樀那把氐奈㈥嚵屑夹g(shù)，這種技術(shù)可以對(duì)環(huán)境樣品進(jìn)行快速、敏感的高通量檢測(cè)。近年來，功能基因芯片日臻成熟，并在土壤微生態(tài)的研究中得到重視和應(yīng)用，在有關(guān)各種生態(tài)系統(tǒng)中以及各種污染壓力下的土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能的研究中提供了大量信息。功能基因芯片的發(fā)展將有助于深入研究土壤微生態(tài)細(xì)節(jié)過程，描述微生物群落的生態(tài)功能網(wǎng)絡(luò)，為預(yù)測(cè)微生物群落對(duì)環(huán)境壓力的響應(yīng)變化提供理論基礎(chǔ)。

　　關(guān)鍵詞：寧夏工程類職稱論文,基因芯片,土壤微生態(tài),功能基因,微生物群落

　　功能基因芯片是新一代分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，通過成千上萬密集排列的核酸探針能夠在短時(shí)間內(nèi)分析大量的核酸分子。大部分以核酸為檢測(cè)對(duì)象的技術(shù)僅提供微生物的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)信息，而功能基因芯片的檢測(cè)對(duì)象為微生物群落的功能基因。基因芯片技術(shù)作為無需培養(yǎng)的高通量檢測(cè)技術(shù)，解決了傳統(tǒng)分子生物學(xué)的低效率問題，以特異性和高度靈敏性來保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，而且可以定量檢測(cè)目的基因。近十年來，功能基因芯片的發(fā)展很大地促進(jìn)了有關(guān)土壤微生態(tài)的活動(dòng)和多樣性的研究[1]。土壤微生物有類群繁多、數(shù)量巨大、分布復(fù)雜、功能多樣等特征[2]，而且現(xiàn)今，氣候變化、工業(yè)化、城市化以及農(nóng)業(yè)的發(fā)展對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生不同程度的壓力，土壤微生物的分布和功能在不斷地發(fā)生變化，然而人們對(duì)此的了解還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足以預(yù)測(cè)微生物的演替充分利用微生物的功能，因此功能基因芯片在土壤微生態(tài)的研究中也得到越來越廣泛的關(guān)注。

　　1功能基因芯片（微陣列）技術(shù)簡(jiǎn)介

　　1.1功能基因芯片原理

　　基因芯片技術(shù)作為新一代的核酸雜交技術(shù)，具有高密度、平行分析、雙色測(cè)定和低背景值等優(yōu)勢(shì)，非常適合于檢測(cè)自然環(huán)境中的微生物[3]。在此技術(shù)中，將大量核酸片段（寡核苷酸、cDNA、基因組DNA）以預(yù)先設(shè)計(jì)的方式固定在載玻片、尼龍膜等載體上組成密集分子排列，再根據(jù)核酸互補(bǔ)雜交原理，與標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交；通過檢測(cè)雜交信號(hào)的強(qiáng)弱，判斷樣品中靶分子的數(shù)量及組成[4]。功能基因芯片是包含有功能基因序列的微陣列，這些功能基因編碼微生物的生物化學(xué)功能的相關(guān)蛋白質(zhì)。

　　功能基因芯片可分為功能分類基因芯片和基因表達(dá)芯片，前者的目的主要是研究菌群是否具有一些涉及特定反應(yīng)過程的基因，可知微生物群落的潛在功能，雜交靶標(biāo)是菌群DNA的PCR產(chǎn)物；而后者用于研究這些特定功能基因的生理活性及其基因真實(shí)表達(dá)的情況，需提取環(huán)境樣品的mRNA，其雜交靶標(biāo)是菌群cDNA的PCR產(chǎn)物[5]。

　　1.2功能基因芯片探針、雜交及數(shù)據(jù)分析

　　制作功能基因陣列的基因探針必須根據(jù)具體所要研究的問題進(jìn)行認(rèn)真選擇。制備功能基因探針的方法有3種：（1）用專一性引物從純培養(yǎng)物的基因組DNA中擴(kuò)增所需的基因片段或以載體特異性引物從含所需基因的載體質(zhì)粒上擴(kuò)增；（2）通過PCR從自然環(huán)境中獲取所需基因片段；（3）使用寡核苷酸探針，根據(jù)數(shù)據(jù)庫中的功能序列信息設(shè)計(jì)并合成較長(zhǎng)的（50～70個(gè)堿基）寡核苷酸探針，固化在陣列上。

　　為了與固定的探針雜交，待測(cè)基因（DNA或mRNA）要經(jīng)PCR、逆轉(zhuǎn)錄、末端標(biāo)記等操作，成為標(biāo)記有熒光染料或同位素的核酸分子。雜交后每個(gè)斑點(diǎn)信號(hào)強(qiáng)度通過計(jì)算機(jī)進(jìn)行處理得到大量信息，并進(jìn)行后續(xù)的數(shù)據(jù)分析工作。數(shù)據(jù)分析一般遵循的技術(shù)路線為生物多樣性分析、群落組成和結(jié)構(gòu)分析、與環(huán)境因子的相關(guān)性分析，以分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)的建立。在生物多樣性分析中，要根據(jù)檢測(cè)到的基因數(shù)量計(jì)算出各項(xiàng)多樣性指數(shù)，如豐度、均勻度，多樣性等等，同時(shí)要把不同樣品中特殊的、唯一的以及共有的基因找出來；在群落組成和結(jié)構(gòu)分析中，可利用的方法有方差分析、聚類分析、除趨勢(shì)對(duì)應(yīng)分析（DetrendedCorrespondenceAnalysis，DCA）、響應(yīng)比分析等多種方法；群落及環(huán)境之間的關(guān)系分析中，可通過典范對(duì)應(yīng)分析、矩陣相關(guān)分析、方差分解分析（VPA）等方法進(jìn)行研究；建立分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)目的是為了更清楚地揭示微生物功能基因和相關(guān)群落之間的關(guān)系[6]。

　　1.3功能基因芯片發(fā)展

　　最初，功能基因芯片由89個(gè)PCR擴(kuò)增探針組成，可以檢測(cè)到純培養(yǎng)物的nirS，nirK，amoA和pmoA等四種功能基因。后來出現(xiàn)的多種功能基因芯片則以關(guān)乎微生物特定功能過程的基因?yàn)槟繕?biāo)，如氮循環(huán)[7-9]，甲烷氧化菌[10]等等。近幾年功能基因芯片已發(fā)展成為有數(shù)千個(gè)甚至數(shù)萬個(gè)探針的綜合性芯片，可同時(shí)檢測(cè)數(shù)萬個(gè)功能基因，涉及到碳、氮等各個(gè)循環(huán)、金屬還原和有機(jī)物降解等各種微生態(tài)功能。其中最具代表性的功能基因芯片是美國(guó)俄克拉荷馬大學(xué)環(huán)境基因組學(xué)研究院Zhou等[11-13]開發(fā)出的Geochip，這種綜合性高通量功能基因芯片通過數(shù)萬個(gè)探針提供有關(guān)功能基因的超大量信息，目前發(fā)展到了Geochip4.0版本[13]。Geochip系列芯片被用于包括土壤、水生態(tài)系統(tǒng)等各種環(huán)境的微生態(tài)研究中，已充分證明此技術(shù)的適用性和發(fā)展前景。然而，功能基因芯片也存在有待進(jìn)一步解決的問題：（1）要發(fā)展強(qiáng)有力的軟件工具來設(shè)計(jì)特異性探針，以應(yīng)對(duì)測(cè)序技術(shù)得到的大量序列信息；（2）面對(duì)環(huán)境樣品中復(fù)雜多樣的微生物資源，需要新方法、新策略來不斷改善基因芯片的敏感性和定量準(zhǔn)確性。

　　2功能基因芯片在土壤微生態(tài)研究中的應(yīng)用功能基因芯片從功能基因的視角探索土壤微生物在不同生態(tài)類型中和不同環(huán)境壓力下的分布及規(guī)律，以及土壤微生物在污染物處理、降解和土壤修復(fù)等方面的作用和機(jī)理，并深入了解碳、氮等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在土壤微生態(tài)系統(tǒng)中循環(huán)、轉(zhuǎn)化作用機(jī)理。由此可見，功能基因芯片為土壤微生態(tài)研究提供了全新的強(qiáng)有力的技術(shù)分析工具，有助于更高效地利用土壤微生物對(duì)污染環(huán)境進(jìn)行綜合治理，或利用生物技術(shù)改選微生物，增強(qiáng)對(duì)外源污染物的降解和轉(zhuǎn)化，同時(shí)為開發(fā)利用微生物資源維持陸地生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性提供了理念基礎(chǔ)。

　　2.1利用功能基因芯片探討不同生態(tài)系統(tǒng)中土壤的

　　微生態(tài)過程

　　功能基因芯片在森林生態(tài)系統(tǒng)、草地生態(tài)系統(tǒng)，農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)等各種不同生態(tài)系統(tǒng)的土壤微生態(tài)研究中都得到了應(yīng)用。He等[14]結(jié)合功能基因芯片和焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)二氧化碳增加壓力下的草地土壤微生物群落變化，發(fā)現(xiàn)在二氧化碳增加壓力下有關(guān)活性碳降解、固碳、固氮以及磷釋放的基因數(shù)量都有所增加，而對(duì)有關(guān)甲烷代謝和難降解性碳降解的基因沒有顯著影響，而且土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和代謝潛力與土壤的碳氮含量、植物生產(chǎn)力密切相關(guān)。這樣的結(jié)果表明二氧化碳的增加改變了微生物群落的結(jié)構(gòu)和組成，微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能的改變會(huì)進(jìn)一步對(duì)碳的流動(dòng)產(chǎn)生影響。Zhang等[15]研究了四川亞高山帶森林中土地利用和覆蓋對(duì)土壤微生物有機(jī)碳降解基因多樣性的影響，其中所用的功能基因陣列包含代表123個(gè)功能基因的1961個(gè)探針。研究結(jié)果表明，在一些土地利用類型場(chǎng)地中功能基因數(shù)量與基因多樣性指數(shù)與土壤有機(jī)碳的增加呈正相關(guān)。Berthrong等[16]用功能基因芯片Geochip2.0（>24000個(gè)探針，可以同時(shí)檢測(cè)數(shù)千個(gè)基因，包括炭循環(huán)的相關(guān)基因）來比較土壤微生物和生物地理化學(xué)功能如何響應(yīng)不同的土地利用類型，結(jié)果表明，草地向森林的轉(zhuǎn)變使土壤的碳氮儲(chǔ)存量發(fā)生了變化：桉樹的種植減少了與氨化和固氮作用相關(guān)的功能基因、碳聚合物降解相關(guān)的基因和幾丁質(zhì)酶功能基因的豐度。另外，Zhou等[17]同樣利用Geochip2.0研究了森林土壤的微生物群落空間分布模式，結(jié)果證明了物種-區(qū)域關(guān)系適用于微生物群落的分布。Reeve等[18]收集了不同管理措施下農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的土壤樣品，利用功能基因芯片探討土壤功能和微生物群落多樣性之間的關(guān)系。這些工作都把環(huán)境壓力、土壤特性，植被等相關(guān)因素與土壤微生物群落的分布和功能緊密地聯(lián)系了起來。還有涉及到極端生態(tài)系統(tǒng)的研究，Yergeau等[19]首次利用包含24243個(gè)寡核苷酸探針（10000多個(gè)與氮、碳、硫和磷循環(huán)和有機(jī)污染物降解相關(guān)的功能基因）的功能基因芯片研究了不同緯度上的南極土壤微生物群落變化，探討了生態(tài)系統(tǒng)中影響碳氮循環(huán)的環(huán)境因素。

　　大部分的研究都是檢測(cè)從土壤樣品提取的DNA，但還有一些研究把目標(biāo)轉(zhuǎn)向了mRNA。Bodrossy等[20]用甲烷氧化菌的功能基因芯片對(duì)垃圾堆肥土壤進(jìn)行了DNA以及mRNA的基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)一些從mRNA中檢測(cè)到的基因在DNA的檢測(cè)中卻未出現(xiàn)，這說明基于mRNA的基因診斷檢測(cè)可以為微生物群落結(jié)構(gòu)和功能補(bǔ)充更多信息。McGrath等[21]構(gòu)建了一個(gè)基于mRNA的環(huán)境功能基因芯片（Environmentalfunctionalgenemicroarray，E-FGA），用于檢測(cè)不同的N2O通量條件下農(nóng)田土壤中的微生物群落活動(dòng)狀態(tài)。檢測(cè)結(jié)果顯示，109個(gè)基因表達(dá)狀況在高產(chǎn)N2O和低產(chǎn)N2O的條件下有明顯的不同，證明功能基因芯片在環(huán)境微生物基因表達(dá)檢測(cè)方面的適用性，其應(yīng)用有助于利用微生物使N2O釋放最少，以便最大程度地為農(nóng)作物保留土壤中的氮素。

　　此外，大多數(shù)的微生物多樣性研究集中在種群水平上的豐度和數(shù)量，少數(shù)學(xué)者關(guān)注了微生物群落之間的相互關(guān)系。對(duì)于數(shù)量巨大，多樣的微生物群落，定義其復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)是一項(xiàng)非常具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)，而高通量功能基因芯片的應(yīng)用可以使這一領(lǐng)域的研究成為可能。Zhou等[22]通過研究提供了一個(gè)基于隨機(jī)矩陣?yán)碚摚╮andommatrixtheory，RMT）的概念框架，利用功能基因芯片獲取了不同二氧化碳濃度下土壤樣品中的數(shù)據(jù)，通過RMT方法從數(shù)據(jù)中自動(dòng)識(shí)別分子網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果表明功能基因的分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)在不同二氮化碳濃度下有明顯的不同，功能基因網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與土壤的地理化學(xué)參數(shù)有關(guān)。

　　2.2利用功能基因芯片探討污染壓力下的土壤微生態(tài)

　　應(yīng)用功能基因分類芯片研究污染土壤的生物降解、生物修復(fù)等過程，在群落和基因的水平上對(duì)微生物進(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測(cè)，為提高修復(fù)降解效率提供可借鑒的理論基礎(chǔ)。

　　Liang等[23]利用功能基因芯片對(duì)位于中國(guó)東北的油田土壤進(jìn)行原位檢測(cè)，考察不同石油污染壓力下的土壤微生物群落多樣性。研究結(jié)果反映了不同污染壓力下的功能基因的響應(yīng)關(guān)系，功能基因的豐度和多樣性隨著污染濃度的增加下降，含油量和土壤有效氮對(duì)微生物功能基因影響最大。鐘毅等[24]以中國(guó)大慶油田典型污染場(chǎng)地土壤為研究對(duì)象，利用基因芯片技術(shù)分析在石油污染、調(diào)節(jié)氮磷營(yíng)養(yǎng)、種植植物（紫花苜蓿、高羊茅和羊草）等不同微生態(tài)環(huán)境下的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)特征。此外，Rhee等[25]為了有效地監(jiān)測(cè)生物降解微生物種群，開發(fā)了基于50-mer寡核苷酸探針的功能基因微陣列，應(yīng)用到多環(huán)芳烴和苯-甲苯-乙苯-二甲苯污染土壤和未污染土壤分析，證明此技術(shù)具有望成為專一、靈敏和可定量的工具來揭示污染環(huán)境樣品中微生物群落和生物降解基因的動(dòng)態(tài)，但其檢測(cè)靈敏度仍需進(jìn)一步改善。Zhang等[26]通過功能基因芯片Geochip進(jìn)行了多環(huán)芳烴污染土壤中微生物功能基因的研究，微生物的多環(huán)芳烴相關(guān)基因與多環(huán)芳烴的濃度之間的關(guān)系有助于闡明不同污染濃度下功能基因的動(dòng)態(tài)機(jī)理。研究結(jié)果表明，雖然污染濃度對(duì)整體的微生物群落產(chǎn)生負(fù)面壓力，但個(gè)別的多環(huán)方烴相關(guān)降解基因隨著污染濃度的增加活動(dòng)更加活躍，說明一些特定的微生物群落在相應(yīng)的環(huán)境壓力下存活率更高。功能基因芯片應(yīng)用于污染土壤研究的優(yōu)勢(shì)在于：可以提供生物修復(fù)降解相關(guān)的關(guān)鍵基因和其他生理功能基因的動(dòng)態(tài)信息，在找出引起這種動(dòng)態(tài)變化的驅(qū)動(dòng)力的同時(shí)，微觀地把微生物在降解修復(fù)中所發(fā)揮的功能與其他生物化學(xué)功能相聯(lián)系，從而描繪在污染壓力下的微生物功能網(wǎng)絡(luò)。

　　3前景展望

　　功能基因芯片是將生物學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)及計(jì)算機(jī)科學(xué)匯集于一體的新型高通量微陣列技術(shù)，因其對(duì)功能基因的針對(duì)性而得到越來越多的關(guān)注。從功能基因角度探討微生物群落，可以深入了解微生物在各個(gè)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)與能量循環(huán)中所發(fā)揮的功能，探討在不同宏觀環(huán)境和污染壓力下微生物功能的改變，追查致使微生物群落的功能和分布發(fā)生變化的關(guān)鍵因子，為更有效地利用微生物資源提供支持。未來，在利用功能基因芯片進(jìn)行土壤微生態(tài)的研究中，應(yīng)在以下兩個(gè)方面深入。

　　（1）給合mRNA的檢測(cè)，研究微生物群落的狀態(tài)及真實(shí)的生理活動(dòng)。因?yàn)闄z測(cè)DNA得到的信息中包括來自無活性細(xì)胞的功能基因，因此要結(jié)合對(duì)mRNA的檢測(cè)，得到功能基因真實(shí)得到表達(dá)的信息來補(bǔ)充。土壤樣品中的核酸提取及純化本身就需要較高的要求，對(duì)樣品前處理的技術(shù)也要越加完善。對(duì)DNA和mRNA的共同關(guān)注有利于得到土壤微生態(tài)系統(tǒng)的更加全面真實(shí)的信息。

　�。�2）重視微生態(tài)細(xì)節(jié)過程，預(yù)測(cè)微生態(tài)在環(huán)境壓力下的響應(yīng)�，F(xiàn)今的生態(tài)模型只是把微生物群落看作是一個(gè)黑匣子，假定生物地理化學(xué)變化與微生物群落的豐度和功能沒有顯著的相關(guān)性，因此一般會(huì)忽視微生態(tài)的細(xì)節(jié)過程。通過功能基因芯片獲取的微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的信息可以打開這個(gè)黑匣子，將信息整合為看得見的微生物群落生態(tài)網(wǎng)絡(luò)，用于預(yù)測(cè)各種環(huán)境壓力下的微生態(tài)響應(yīng)。

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