據(jù)統(tǒng)計，中國每年豆渣產(chǎn)量在2000萬t左右，如此大量的豆渣利用是一個難題[1]。研究表明，干豆渣中含20%左右的蛋白質(zhì)，50%左右的膳食纖維素，10%左右的脂肪，以及豐富的鈣、磷等礦物質(zhì)元素和維生素，其中含有的膳食纖維素已被稱為第七種營養(yǎng)素，可以預(yù)防結(jié)腸癌、膽結(jié)石、降低膽固醇、預(yù)防由冠狀動脈硬化引起的心臟病，降低糖尿病人的血糖水平，是一種優(yōu)質(zhì)的保健食品原料，同時，豆渣來源廣泛，價格低，開發(fā)保健食品具有廣泛的應(yīng)用前景[2，3]。為此，以豆渣為固體培養(yǎng)基培養(yǎng)靈芝，研究最佳發(fā)酵條件，為豆制品加工副產(chǎn)物利用提供理論依據(jù)。

　　摘要：為了提高豆渣附加值，以豆渣為基質(zhì)固體發(fā)酵赤靈芝[Ganodermalucidum（Curtis∶Fr）P.Karst]，通過單因素試驗研究了發(fā)酵時間、接種量、培養(yǎng)溫度及蔗糖添加量對靈芝菌絲生長和發(fā)酵豆渣多糖含量的影響，并用正交試驗優(yōu)化了發(fā)酵條件。結(jié)果表明，蔗糖添加量1.0%、接種量12%、培養(yǎng)時間12d、培養(yǎng)溫度27℃條件下發(fā)酵豆渣多糖含量最高。

　　關(guān)鍵詞：赤靈芝[Ganodermalucidum（Curtis∶Fr）P.Karst],豆渣,多糖,培養(yǎng)條件,農(nóng)業(yè)研究論文

　　1材料與方法

　　1.1材料

　　赤靈芝菌種，購于華中農(nóng)業(yè)大學食用菌研究中心。豆渣，市售。

　　1.2方法

　　1.2.1培養(yǎng)基的制備固體培養(yǎng)基：PAD培養(yǎng)基（土豆200g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O0.5g，瓊脂17g，去離子水1000mL），分裝于試管，121℃滅菌20min，擺斜面，備用。

　　液體培養(yǎng)基：PAD培養(yǎng)基（土豆200g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O0.5g，去離子水1000mL），分裝于250mL三角瓶內(nèi)，120mL/瓶，121℃滅菌20min，備用。

　　1.2.2菌種的制備

　　1）菌種活化。在無菌條件下，從原始菌種斜面上挑取0.3cm×0.3cm大小菌塊，轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)5～7d，菌絲長滿斜面后備用。

　　2）液體種子的制備。在液體培養(yǎng)基中接入3塊黃豆粒大小的赤靈芝活化菌種，于150r/min旋轉(zhuǎn)式搖床30℃培養(yǎng)5d，備用。

　　3）赤靈芝發(fā)酵豆渣工藝流程。新鮮豆渣→復(fù)配→滅菌→冷卻→接種→發(fā)酵。將50g豆渣裝入100mL的三角瓶中，壓實，121℃下滅菌20min，冷卻后無菌條件下接種。

　　1.2.3豆渣發(fā)酵條件的優(yōu)化

　　1）豆渣發(fā)酵條件的單因素試驗。①蔗糖添加量對豆渣發(fā)酵品質(zhì)的影響試驗。分別稱取0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00g蔗糖，加入50g鮮豆渣中，混勻，即蔗糖添加量分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%，控制溫度27℃，接種量8%，培養(yǎng)10d，通過感官評價及多糖含量確定豆渣發(fā)酵的最佳蔗糖添加量；②接種量對豆渣發(fā)酵品質(zhì)的影響試驗。吸取1、2、3、4、5、6mL的菌液于滅過菌的豆渣培養(yǎng)基中，即接種量分別為2%、4%、6%、8%、10%、12%，培養(yǎng)溫度27℃，蔗糖添加量2%，培養(yǎng)10d，通過感官評價及多糖含量確定豆渣發(fā)酵的最佳接種量。③培養(yǎng)溫度對豆渣發(fā)酵品質(zhì)的影響試驗。在蔗糖添加量2%，接種量8%，培養(yǎng)溫度分別設(shè)定為21、24、27、30、33℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)10d，通過感官評價及多糖含量確定豆渣發(fā)酵的最佳溫度；④發(fā)酵時間對豆渣發(fā)酵品質(zhì)的影響試驗。蔗糖添加量2.0%，培養(yǎng)溫度27℃，接種量為8%，發(fā)酵時間分別為4、6、8、10、12、14d，通過感官評價及多糖含量確定豆渣發(fā)酵的最佳接種量。

　　2）豆渣發(fā)酵最佳條件正交試驗。試驗根據(jù)單因素試驗結(jié)果，每個因素選取3個水平，通過4因素3水平的正交試驗（表1）分析比較發(fā)酵豆渣中多糖含量，確定最佳發(fā)酵條件。

　　1.2.4指標測定

　　1）發(fā)酵豆渣的感官評定方法。主要針對其外觀、質(zhì)地及風味3個方面屬性進行評定（表2）。計算公式：感官評定得分=外觀得分×0.4+質(zhì)地得分×0.3+氣味得分×0.3。

　　2）多糖含量測定。①葡萄糖標準曲線的制定。精密量取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL的100mg/L標準葡萄糖溶液分別置于15mL的試管中，加去離子水補足1.0mL，分別加入5%的苯酚1.0mL，然后快速加入5.0mL硫酸（與液面垂直加入，勿接觸試管壁，以便與反應(yīng)液充分混合），靜置10min。使用渦旋振蕩器使反應(yīng)液充分混合，然后將試管置于30℃環(huán)境中反應(yīng)20min，在490nm波長處測吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，制作標準曲線（圖1）。②樣品測定。稱量樣品5g，精確到0.001g，置于100mL的三角瓶內(nèi)，第一次提取料液比為1∶6（m/V，g∶mL，下同），提取2h，離心分離后再按料液比1∶4加入去離子水提取2h，合并兩次提取液。吸取提取液0.5mL加入3倍體積的95%的乙醇混合，靜置過夜以沉淀粗多糖，然后于10000r/min離心10min，棄去上清液。不溶物用1.5mL的去離子水洗滌溶解，待測。吸取0.1mL待測樣品，按上述步驟操作，測A490nm，以標準曲線計算多糖含量。

　　2結(jié)果與分析

　　2.1單因素試驗結(jié)果

　　2.1.1發(fā)酵條件對發(fā)酵豆渣感官質(zhì)量的影響由圖2可以看出，發(fā)酵溫度、接種量、蔗糖添加量和培養(yǎng)時間對豆渣的發(fā)酵都有影響，發(fā)酵溫度在27℃時靈芝菌絲粗壯細密，感官評價最好，溫度過低菌絲生長速度慢，溫度過高菌絲生長細弱，容易液化；接種量越大菌絲生長速度越快，但是接種量加大，發(fā)酵體系中水分含量和糖含量會增加，試驗表明接種量為10%比較合適；蔗糖添加量對菌絲影響較大，添加0.50g蔗糖菌絲生長最好，隨添加量增大，發(fā)酵豆渣感官評價值降低，可能與蔗糖增加發(fā)酵體系滲透壓加大，不利于菌絲生長，再者，蔗糖添加量增大發(fā)酵體系酸堿度降低，從而不利于菌絲生長；培養(yǎng)時間對發(fā)酵豆渣也有影響，時間過短，豆渣發(fā)酵不充分。2.1.2蔗糖添加量對發(fā)酵豆渣多糖含量的影響由圖3可知，蔗糖添加量對發(fā)酵豆渣多糖含量影響不大，不同處理豆渣多糖含量大多在8.00%～11.00%，各處理之間差異不顯著，因此選擇添加量為1.0%作為豆渣發(fā)酵優(yōu)化試驗添加量。

　　2.1.3接種量對發(fā)酵豆渣多糖含量的影響由圖4可知，在接種量2%～8%時隨接種量增加，發(fā)酵豆渣中多糖含量增大，繼續(xù)增加接種量發(fā)酵豆渣中多糖含量趨于平穩(wěn)，可能的原因是接種量低豆渣中靈芝菌絲體生長速度慢，發(fā)酵豆渣中纖維素分解速度也慢，多糖含量較低，隨接種量增加，發(fā)酵豆渣培養(yǎng)基中靈芝菌絲生長速度增加，在接種量達10%左右時趨于平穩(wěn)。

　　2.1.4溫度對發(fā)酵豆渣多糖含量的影響由圖5可知，培養(yǎng)溫度對發(fā)酵豆渣中多糖含量影響較大，主要原因與發(fā)酵豆渣中靈芝菌絲有很大關(guān)系，培養(yǎng)溫度低，菌絲生長速度慢，同時，高溫會抑制靈芝菌絲的生長，與感官評價的結(jié)果比較一致。

　　2.1.5發(fā)酵時間對發(fā)酵豆渣多糖含量的影響由圖6可知，隨發(fā)酵時間延長，發(fā)酵豆渣中多糖含量總體呈先升高后降低的趨勢，在接種后的8d發(fā)酵豆渣中多糖含量最高，然后降低，趨勢與菌絲生長情況比較一致，4d時發(fā)酵時間短，菌絲未吃透，12d以后菌絲衰敗，出現(xiàn)液化現(xiàn)象。

　　2.2豆渣發(fā)酵條件的優(yōu)化

　　正交試驗結(jié)果（表3）表明，影響發(fā)酵豆渣多糖含量的因素主次順序依次為蔗糖添加量、培養(yǎng)溫度、發(fā)酵時間、接種量，優(yōu)化得到的豆渣發(fā)酵制備靈芝多糖最佳條件為蔗糖添加量1.0%，接種量12%，發(fā)酵時間12d，培養(yǎng)溫度27℃，通過優(yōu)化，發(fā)酵豆渣中多糖含量達10.41%，為未發(fā)酵前的1.9倍。

　　3討論

　　豆渣是制備豆腐、豆?jié){等的副產(chǎn)物，每年的量都很大，據(jù)統(tǒng)計，每加工1kg大豆會產(chǎn)生2kg的豆渣，以此推斷中國每年的豆渣產(chǎn)量在2000萬t以上。豆渣因具有豐富的營養(yǎng)成分，所以鮮豆渣利用一直是世界難題[4，5]。豆渣中的營養(yǎng)物質(zhì)的含量能夠滿足藥用真菌的生長要求。丁玉萍等[6]以豆渣為主要原料，應(yīng)用正交試驗法對香菇液體發(fā)酵最佳培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行了研究，結(jié)果表明，香菇液體發(fā)酵最佳培養(yǎng)基配方為葡萄糖2%，MgSO40.05%，豆渣9%，KH2PO40.1%，并用洗渣水替代水配料；適宜的發(fā)酵條件為發(fā)酵時間6d，裝液量250mL三角瓶裝液80mL，發(fā)酵溫度25℃。靈芝是公認的具有提高免疫力、抗腫瘤活性的藥用真菌，其含有的靈芝多糖等物質(zhì)具有安神、提高免疫力等作用[7]。傳統(tǒng)獲取靈芝多糖的方法是用靈芝子實體進行提取，提取過程需要消耗大量的熱能和水，而提取率一般在2%以下，提取成本很高[7，8]。研究結(jié)果表明，采用豆渣發(fā)酵制備靈芝多糖是獲取靈芝多糖的有效方法，發(fā)酵豆渣中多糖含量可達10%以上，而且具有豆渣原料便宜、發(fā)酵時間短等優(yōu)點。發(fā)酵豆渣培養(yǎng)靈芝獲得的多糖與靈芝子實體中多糖在結(jié)構(gòu)和功能上的區(qū)別還需要進一步研究。

　　參考文獻：

　　[1]孫艷輝，董英.響應(yīng)面法優(yōu)化以豆渣為基質(zhì)發(fā)酵納豆菌[J].食品科學，2007，28（4）：208-211.

　　[2]謝婧.豆渣發(fā)酵過程中主要營養(yǎng)保健成分變化規(guī)律的研究[D].長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學，2008.

　　[3]肖少香.豆渣發(fā)酵技術(shù)的研究[J].食品科技，2007（7）：72-75.

　　[4]朱運平.豆渣的營養(yǎng)功能特性[J].營養(yǎng)健康新觀察，2006（2）：47-49.

　　[5]張振山，葉素萍.豆渣加工的處理與加工利用[J].食品科學，2004，25（10）：400-406.

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