茶樹[Camelliasinensis（L.）O.Kuntze]是多年生異花授粉的木本植物，因其葉含有多種對(duì)人體有益的功能成分，而被作為一種經(jīng)濟(jì)作物廣泛栽培。生產(chǎn)上茶樹多采用無性繁殖以保持其優(yōu)良性狀，卻易導(dǎo)致品種退化和病蟲害抗性降低[1]。雜交育種是培育茶樹新品種的重要途徑之一。

　　摘要：為開展茶樹[Camelliasinensis（L.）O.Kuntze]雜交育種工作，以茶樹品種臺(tái)茶12號(hào)（C.sinensis‘Taicha12’）和福鼎大白茶（C.sinensis‘Fuding-dabaicha’）為試材，采用離體培養(yǎng)法開展花粉生活力與貯藏力研究。結(jié)果表明，H3BO3、蔗糖、pH、瓊脂濃度以及萌發(fā)溫度對(duì)供試的兩種茶樹花粉離體發(fā)芽率均有明顯影響。兩種茶樹花粉離體萌發(fā)的最適培養(yǎng)基成分均為300mg/LCa（NO3）2+200mg/LMgSO4+100mg/LKNO3+100mg/LH3BO3+10%蔗糖+1.0%瓊脂，最適pH5.4，適宜萌發(fā)溫度為16～21℃。貯藏溫度對(duì)茶樹花粉生活力保持具有顯著影響，溫度越低越有利于花粉活力的保持。-70℃最適于茶樹花粉的長(zhǎng)期貯藏，貯藏180d后，臺(tái)茶12號(hào)、福鼎大白茶的花粉發(fā)芽率分別為71.12%、50.61%。在生產(chǎn)實(shí)踐中，-20℃貯藏茶樹花粉亦可取得較好的效果，貯藏180d后，臺(tái)茶12號(hào)、福鼎大白茶的花粉發(fā)芽率分別為60.16%、46.88%。

　　關(guān)鍵詞：臺(tái)茶12號(hào),福鼎大白茶,花粉,離體萌發(fā),生活力,貯藏力

　　但茶樹為異花授粉的蟲媒花植物，且開花期間氣溫低、昆蟲活動(dòng)少，導(dǎo)致茶樹天然結(jié)實(shí)率較低[2]。在育種實(shí)踐中，往往由于茶樹親本的花期不遇給雜交育種工作造成很大困難。茶樹花粉的生活力與貯藏力研究為解決這些問題提供了一條思路，對(duì)茶樹雜交育種以及種質(zhì)資源保存具有一定的理論與實(shí)踐意義[3，4]。目前，關(guān)于茶樹花粉生活力和貯藏力的研究報(bào)道較少[4-8]。鑒于此，以華中農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)種植的兩個(gè)茶樹品種為試材，開展花粉生活力與貯藏力研究，以期為茶樹雜交育種與優(yōu)良種質(zhì)保存提供參考。

　　1材料與方法

　　1.1材料

　　以華中農(nóng)業(yè)大學(xué)茶園引種栽培的的兩個(gè)品種為試材。臺(tái)茶12號(hào)（C.sinensis‘Taicha12’）：由臺(tái)灣省茶葉改良場(chǎng)選育，無性系，灌木型，中葉類，中生種[1，2]。福鼎大白茶（C.sinensis‘Fuding-dabaicha’）：由福建省福鼎市點(diǎn)頭鎮(zhèn)柏柳村選育，無性系，小喬木型，中葉類，早生種[1，2]。

　　1.2方法

　　1.2.1花粉采集及貯藏于2010年12月盛花期間天氣晴好的上午，采集生長(zhǎng)良好的福鼎大白茶、臺(tái)茶12號(hào)的大蕾期花朵。攤放于白紙上，并置于陰涼通風(fēng)干燥處放置24h使花蕾開放、花藥開裂。用毛筆輕輕刷下花粉，并置于陰涼通風(fēng)干燥處，至抖動(dòng)花粉不結(jié)塊時(shí)收集。取少許新鮮花粉用于篩選適宜萌發(fā)的培養(yǎng)基以及檢測(cè)花粉生活力試驗(yàn)。剩余花粉分別裝入離心管中，以脫脂棉封口，置于干燥器中，花粉體積不超過離心管體積的1/3。將干燥器分別置于室溫（RT）、4、-20、-70℃下避光貯藏。

　　1.2.2花粉生活力檢測(cè)采用人工離體萌發(fā)法檢測(cè)花粉生活力，具體試驗(yàn)方法及步驟如下。

　　1）花粉的吸水處理。播種前，取新鮮花粉于4℃、暗環(huán)境、飽和空氣濕度條件下放置2h，以充分吸水[9]。

　　2）培養(yǎng)基中各因素對(duì)花粉離體萌發(fā)的影響。茶樹喜酸性土壤，以臺(tái)茶12號(hào)為試材，分別設(shè)置瓊脂濃度、pH、蔗糖、H3BO3四因素各三個(gè)水平，進(jìn)行正交試驗(yàn)（表1），以初步確定各因素對(duì)花粉離體萌發(fā)的影響。播種時(shí)，用解剖針將充分吸水的花粉均勻播種于培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)基置于鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，蓋上培養(yǎng)皿，于25℃暗培養(yǎng)24h后觀察花粉萌發(fā)情況[10]。每個(gè)培養(yǎng)皿于10×10顯微鏡下觀察，每個(gè)視野不少于50�；ǚ�，記錄每個(gè)視野的發(fā)芽率（萌發(fā)花粉數(shù)/花粉總數(shù)），以花粉管長(zhǎng)度大于花粉直徑時(shí)記為萌發(fā)。取6個(gè)視野的平均值作為該培養(yǎng)基的花粉發(fā)芽率，初步確定花粉離體培養(yǎng)時(shí)各因素適宜的水平。

　　3）兩種花粉最適離體萌發(fā)培養(yǎng)基的篩選。為了篩選兩種花粉最適離體萌發(fā)培養(yǎng)基，在上述試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)置10種固體培養(yǎng)基，pH5.4，基本成分為1.0%瓊脂+300mg/LCa（NO3）2+200mg/LMgSO4+100mg/LKNO3，設(shè)置3種添加量的蔗糖（5%、10%、15%）和3種濃度的H3BO3（50、100、200mg/L）進(jìn)行完全組合，以不添加蔗糖和H3BO3的基本培養(yǎng)基為對(duì)照（表2）。

　　4）萌發(fā)溫度對(duì)花粉離體萌發(fā)的影響。茶樹于冬季低溫期開花。以臺(tái)茶12號(hào)新鮮花粉為試材，對(duì)萌發(fā)溫度、培養(yǎng)基瓊脂含量與pH對(duì)花粉離體萌發(fā)的影響進(jìn)行了研究。將花粉吸水后播種于最適培養(yǎng)基上，分別置于4℃、室溫（16～21℃）、28℃、37℃下進(jìn)行暗培養(yǎng)，培養(yǎng)8、24h后進(jìn)行花粉生活力測(cè)定。

　　1.2.3貯藏期間花粉生活力的測(cè)定以福鼎大白茶和臺(tái)茶12號(hào)花粉為試材，取出4種溫度下貯藏0、7、15、30、60、120、180d的花粉，置于4℃下吸水2h后播種于上述試驗(yàn)篩選的最適離體萌發(fā)培養(yǎng)基，進(jìn)行生活力測(cè)定，以此確定兩種供試花粉的貯藏力。

　　1.2.4數(shù)據(jù)分析方差分析、多重比較采用SAS8.1統(tǒng)計(jì)軟件分析。所有百分?jǐn)?shù)都進(jìn)行反正弦轉(zhuǎn)換后再用于數(shù)據(jù)分析。

　　2結(jié)果與分析

　　2.1培養(yǎng)條件對(duì)茶樹花粉離體萌發(fā)的影響2.1.1培養(yǎng)基各因素對(duì)臺(tái)茶12號(hào)花粉離體萌發(fā)的影響從表1和表2可以看出，瓊脂、pH、蔗糖、H3BO34個(gè)因素均對(duì)臺(tái)茶12號(hào)花粉的萌發(fā)產(chǎn)生了明顯的影響，各因素對(duì)茶樹花粉離體發(fā)芽率的影響從大到小為pH、H3BO3、瓊脂、蔗糖。pH的影響最為明顯，因此，合適的pH對(duì)花粉離體培養(yǎng)成功與否至關(guān)重要。1.0%的瓊脂更有利于花粉的離體萌發(fā)。隨著H3BO3和蔗糖添加量的增多，花粉發(fā)芽率總體呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，說明低于和高于最適宜的H3BO3和蔗糖濃度均會(huì)對(duì)花粉萌發(fā)產(chǎn)生一定的抑制作用。根據(jù)以上結(jié)果，篩選出最適宜臺(tái)茶12號(hào)萌發(fā)的培養(yǎng)基組合為：1.0%瓊脂+10%蔗糖+100mg/LH3BO3+300mg/LCa（NO3）2+200mg/LMgSO4+100mg/LKNO3，pH5.4。

　　2.1.2最適離體培養(yǎng)基的篩選由表2可以看出，H3BO3、蔗糖及其交互作用對(duì)兩種茶樹花粉的發(fā)芽率均有明顯影響。添加蔗糖和H3BO3后，兩種花粉的發(fā)芽率均明顯高于對(duì)照。當(dāng)蔗糖添加量一定時(shí)，花粉發(fā)芽率隨H3BO3濃度增加呈不同的變化趨勢(shì)；當(dāng)H3BO3濃度一定時(shí)，花粉發(fā)芽率也隨蔗糖添加量的增加呈不同的變化趨勢(shì)�？梢�，適宜濃度的蔗糖、H3BO3對(duì)供試茶樹花粉離體萌發(fā)有明顯的促進(jìn)作用。在培養(yǎng)基S2B2上，福鼎大白茶和臺(tái)茶12號(hào)的花粉發(fā)芽率均達(dá)到了最大值，分別為54.09%和64.02%，明顯高于其他培養(yǎng)基上的發(fā)芽率。可見，培養(yǎng)基S2B2適合茶樹花粉離體萌發(fā)。此外，對(duì)各種培養(yǎng)基上福鼎大白茶與臺(tái)茶12號(hào)的花粉發(fā)芽率進(jìn)行比較，兩種茶樹花粉發(fā)芽率差異明顯，說明茶樹花粉發(fā)芽率存在種間差異。

　　綜上所述，供試培養(yǎng)基中，最適宜的福鼎大白茶和臺(tái)茶12號(hào)花粉離體萌發(fā)的培養(yǎng)基組成均為：基本成分+10%蔗糖+100mg/LH3BO3，這與正交試驗(yàn)結(jié)果一致，說明正交試驗(yàn)結(jié)果較為可靠。

　　2.1.3培養(yǎng)溫度對(duì)茶樹花粉萌發(fā)的影響從表3可以看出，臺(tái)茶12號(hào)花粉在4～37℃均可萌發(fā)。花粉培養(yǎng)8h后，4℃、室溫（16～21℃）、28℃、37℃下的花粉發(fā)芽率差異顯著。其中室溫條件下花粉發(fā)芽率最高，為37.56%，其次為28℃和4℃，37℃條件下花粉發(fā)芽率最低，為11.70%。

　　隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各溫度條件下的花粉發(fā)芽率均有所增加。其中，37℃下花粉發(fā)芽率始終最小，培養(yǎng)24h發(fā)芽率為14.03%，說明高溫不適宜茶樹花粉的離體萌發(fā)。4℃下的花粉發(fā)芽率增長(zhǎng)最快，培養(yǎng)24h后發(fā)芽率已超過室溫和28℃，增至最大，達(dá)到45.46%。多重比較結(jié)果顯示，培養(yǎng)24h時(shí)4℃與室溫、28℃下的花粉發(fā)芽率差異顯著。由此可見，4～21℃下茶樹花粉都可以充分萌發(fā)，但以低溫下萌發(fā)情況較好，可能跟臺(tái)茶12號(hào)于冬季低溫期開花、授粉的習(xí)性具有一定的關(guān)系。

　　2.2貯藏時(shí)間和溫度對(duì)茶樹花粉生活力的影響

　　2.2.1貯藏時(shí)間對(duì)花粉發(fā)芽率的影響隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，各貯藏溫度下福鼎大白茶、臺(tái)茶12號(hào)花粉的生活力總體呈逐漸降低的趨勢(shì)，即貯藏時(shí)間越長(zhǎng)花粉發(fā)芽率越低。對(duì)福鼎大白茶而言，整個(gè)貯藏期內(nèi)，不同溫度下貯藏花粉的發(fā)芽率呈現(xiàn)很大的差異，但是在貯藏前60d內(nèi)，僅有小幅度降低，仍均保持在40%以上。多重比較結(jié)果表明，此時(shí)不同溫度之間的發(fā)芽率無顯著差異。但是在隨后的貯藏時(shí)間里，各貯藏溫度之間的發(fā)芽率開始呈現(xiàn)顯著差異。其中室溫下發(fā)芽率急劇降低，至180d時(shí)，花粉已完全失活；4℃下貯藏60d后也開始大幅度下降，至180d時(shí)發(fā)芽率僅有20.45%；而在-20℃和-70℃下，在整個(gè)貯藏期間花粉發(fā)芽率僅有小幅度下降，至180d時(shí)發(fā)芽率仍分別有46.88%和50.61%（圖1）。

　　對(duì)于臺(tái)茶12號(hào)而言，不同溫度下貯藏花粉的發(fā)芽率降幅亦呈現(xiàn)很大的差異，但是在貯藏前30d內(nèi)降幅均較小，發(fā)芽率仍均保持在60%以上。多重比較結(jié)果顯示，此時(shí)不同溫度之間的發(fā)芽率無顯著差異。但是在隨后的貯藏期間，各貯藏溫度之間的發(fā)芽率開始呈現(xiàn)顯著差異。其中室溫下貯藏30d后花粉發(fā)芽率開始大幅下降，至180d時(shí)花粉已完全失活；4℃下貯藏120d后開始大幅度下降，至180d時(shí)發(fā)芽率僅有18.79%；而在-20℃和-70℃下，在整個(gè)貯藏期間花粉發(fā)芽率僅有小幅度下降，至180d時(shí)發(fā)芽率仍分別有60.16%和71.12%（圖2）。

　　綜上所述，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，福鼎大白茶和臺(tái)茶12號(hào)花粉活力均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。但是通過采取降低貯藏溫度的措施可有效延長(zhǎng)花粉貯藏期，保持花粉活力在較高水平，同時(shí)也說明兩種供試花粉有長(zhǎng)期貯藏的潛能。

　　2.2.2貯藏溫度對(duì)花粉發(fā)芽率的影響從圖1和圖2可以看出，在相同的貯藏期內(nèi)，貯藏溫度越低越有利于茶樹花粉活力的保持；貯藏時(shí)期越長(zhǎng)，貯藏溫度越低越有利于花粉活力的保持。對(duì)于福鼎大白茶，短期貯藏（60d以內(nèi)）時(shí)，4種貯藏溫度之間的發(fā)芽率差異不顯著，因此可采用4℃或者-20℃進(jìn)行花粉貯藏，簡(jiǎn)便易行。在長(zhǎng)期貯藏中（180d）-20℃和-70℃效果最好，二者之間發(fā)芽率差異不顯著，因此亦可采用-20℃進(jìn)行貯藏，以節(jié)約成本。對(duì)于臺(tái)茶12號(hào)，短期貯藏（30d內(nèi)）各貯藏溫度之間的發(fā)芽率差異不顯著，于室溫、4℃和-20℃下貯藏均可；貯藏120d內(nèi)，4℃、-20℃和-70℃之間差異不顯著，因此，采用4℃和-20℃下貯藏即可；貯藏180d時(shí)，以-70℃貯藏的效果最好，且-20℃和-70℃之間差異不顯著，因此采用-20℃下貯藏亦可較大程度保持花粉的活力。

　　2.2.3不同貯藏溫度下花粉顏色的變化貯藏期間兩種供試花粉的顏色均呈現(xiàn)由金黃色、明亮→黃色、明亮→淡黃色→灰白色不同程度的變化（圖3）。其中，金黃色、明亮的茶樹花粉發(fā)芽率高，活力強(qiáng)，隨著顏色變暗，其活力也逐漸降低。當(dāng)顏色呈灰白色、光澤偏暗時(shí)，生活力即喪失。同一品種花粉在不同溫度條件下貯藏180d后顏色變化差異較大，貯藏溫度越低，顏色保持得越鮮亮，花粉發(fā)芽率越高；而貯藏溫度越高，顏色逐漸呈現(xiàn)灰白色，無光澤，花粉發(fā)芽率越低，甚至喪失活力。說明茶樹花粉顏色變化與其活力變化具有一定的相關(guān)性。因此，在生產(chǎn)實(shí)踐中，可根據(jù)貯藏花粉的色澤來初步判斷花粉活力的有無，大大簡(jiǎn)化了花粉活力檢測(cè)手段，提高了工作效率。3小結(jié)與討論

　　花粉是種子植物的雄配子體，在有性繁殖中發(fā)揮著重要作用。而對(duì)新鮮花粉和貯存期間的花粉生活力進(jìn)行檢測(cè)，則可以掌握花粉的形態(tài)及生理特征，評(píng)估花粉是否有受精能力等[11]。目前，可用于檢測(cè)新鮮花粉及貯藏期間花粉生活力的方法有多種[12]，其中花粉離體萌發(fā)法因簡(jiǎn)便快捷，直觀可靠，花粉發(fā)芽率被認(rèn)為是評(píng)估花粉活力的最佳指標(biāo)[13]，因此，花粉離體萌發(fā)法不僅成為最常用的花粉生活力檢測(cè)手段，也是分析有性繁殖基本問題的主要思路[14]。

　　3.1影響茶樹花粉生活力的因素

　　在離體培養(yǎng)的各因素中，H3BO3及蔗糖的濃度對(duì)花粉離體萌發(fā)影響較大[15]，適量的蔗糖和H3BO3有利于花粉的萌發(fā)[10，16]。試驗(yàn)中不同蔗糖、H3BO3添加量對(duì)茶樹花粉萌發(fā)有明顯的影響，且H3BO3與蔗糖之間存在明顯的交互作用。兩種茶樹花粉萌發(fā)的最佳蔗糖、H3BO3添加量均為10%、100mg/L；適量的蔗糖與H3BO3明顯促進(jìn)了茶樹花粉的萌發(fā)。

　　其次，培養(yǎng)溫度、pH、瓊脂含量都對(duì)花粉離體萌發(fā)具有一定的影響。極端培養(yǎng)環(huán)境如高溫和高濕脅迫，不僅使花粉萌發(fā)受到抑制，而且花粉形態(tài)也有可能發(fā)生改變[13，17]。本研究中，4℃和室溫（16～21℃）下較適宜茶樹花粉的離體萌發(fā)，花粉形態(tài)和花粉管生長(zhǎng)均正常。而在37℃下，花粉呈褐色，部分花粉干癟開裂。此外，在28℃和37℃下培養(yǎng)的茶樹花粉，其花粉管長(zhǎng)度明顯短于其他溫度下的，說明高溫不利于茶樹花粉管伸長(zhǎng)，這可能與茶樹盛花期間氣溫低、日溫差大等環(huán)境因素具有一定的相關(guān)性。

　　3.2花粉離體萌發(fā)的通用培養(yǎng)基

　　試驗(yàn)篩選的最適培養(yǎng)基組合（1.0%瓊脂+300mg/LCa（NO3）2+200mg/LMgSO4+100mg/LKNO3+10%蔗糖+100mg/LH3BO3）與Brewbaker等[18]報(bào)道的適合39科79屬86種植物花粉萌發(fā)的培養(yǎng)基組合基本一致。說明該培養(yǎng)基適合于多數(shù)植物的花粉生活力檢測(cè)，可作為植物花粉離體萌發(fā)的通用培養(yǎng)基。在對(duì)某種植物首次進(jìn)行花粉生活力測(cè)定時(shí)，可先采用該培養(yǎng)基進(jìn)行探索，從而簡(jiǎn)化了培養(yǎng)基篩選過程，加快了試驗(yàn)進(jìn)度，保留了新鮮花粉的活力，保證了試驗(yàn)的可靠性。

　　3.3溫度對(duì)茶樹花粉貯藏的影響

　　花粉活力保持時(shí)間由基因型決定[19]，同時(shí)植物花粉小，貯藏的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有限，而其呼吸作用又比較強(qiáng)烈。因此，花粉生活力會(huì)因高強(qiáng)度呼吸導(dǎo)致花粉養(yǎng)分消耗過度而降低[20]。而貯藏前對(duì)花粉進(jìn)行干燥處理降低花粉含水量，貯藏時(shí)選取低溫、低O2含量、避光等條件將使花粉細(xì)胞內(nèi)部各種代謝活動(dòng)減緩，在相同時(shí)間內(nèi)即可減少花粉有機(jī)物質(zhì)消耗，利于延長(zhǎng)花粉的壽命[21]。已有研究證實(shí)溫濕度對(duì)茶樹花粉貯藏影響較大[4-7]，本研究探討了4種溫度下貯藏兩種供試花粉的活力變化。

　　貯藏溫度對(duì)兩個(gè)茶樹品種的花粉生活力保持具有顯著影響，且品種間受貯藏溫度的影響也存在差異。溫度越低越有利于花粉活力的保持，室溫條件下，花粉貯藏120d生活力即降低至50%以下，180d后即完全失活。4℃可應(yīng)用于兩種花粉的短期貯藏（60d內(nèi)），貯藏60d時(shí)，臺(tái)茶12號(hào)、福鼎大白茶的花粉發(fā)芽率分別為65.60%、45.14%，這為解決茶樹育種授粉時(shí)花期不遇提供了較為簡(jiǎn)單的解決方案。-70℃最適于茶樹花粉的長(zhǎng)期貯藏（180d）；貯藏180d后，臺(tái)茶12號(hào)、福鼎大白茶的花粉發(fā)芽率分別為71.12%、50.61%；而-20℃貯藏180d后，臺(tái)茶12號(hào)、福鼎大白茶的花粉發(fā)芽率分別為60.16%、46.88%，仍具有一定的雜交可行性，可用于雜交育種工作的開展。因此，可根據(jù)實(shí)際的貯藏條件和貯藏所需天數(shù)制定兩種供試花粉的貯藏方案，巧妙安排，合理利用。由于時(shí)間限制，本研究?jī)H進(jìn)行了180d，展現(xiàn)了不同貯藏溫度下兩種供試花粉的活力變化趨勢(shì)，可以滿足當(dāng)季雜交工作的開展，但仍有必要探討貯藏360d時(shí)花粉活力的保持情況。此外，貯藏后的花粉能否完成受精作用尚需進(jìn)一步試驗(yàn)探討。

　　參考文獻(xiàn)：

　　[1]駱耀平.茶樹栽培學(xué)[M].第四版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2008.

　　[2]江昌俊.茶樹育種學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2005.

　　[3]AMMAS，WATANABEA.Long-termstorageofgermplasmoftea（Camelliasinensis（L.）O.Kuntze）[J].JapanAgriculturalResearchQuarterly，1985，19（3）：196-201.

　　[4]楊素娟，王玉書，王立，等.茶樹花粉的超低溫保存[J].茶葉科學(xué)，1993，13（1）：27-30.

　　[5]陳國(guó)本.茶樹花粉生活力及其貯藏[J].茶葉通訊，1963（4-5）：23-28，15.

　　[6]梁月榮.茶樹花粉貯藏的研究[J].中國(guó)茶葉，1985（3）：6.

　　[7]應(yīng)華軍.貯藏時(shí)間對(duì)茶樹花粉生活力的影響[J].中國(guó)茶葉，1992（2）：24-26.

　　[8]楊盛美，宋維希，唐一春，等.茶組植物花粉生活力測(cè)定及種間雜交研究[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（8）：115-118.

---

轉(zhuǎn)載請(qǐng)注明來自：http://www.jinnzone.com/nognyelwfabiao/35240.html