化工論文投稿期刊推薦《哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)報（社會科學(xué)版）》創(chuàng)刊于1999年，國防科工委主管，哈爾濱工業(yè)大學(xué)主辦，是人文社會科學(xué)綜合性學(xué)術(shù)刊物，雙月刊。被中國核心期刊 （遴選）數(shù)據(jù)庫、中國期刊全文數(shù)據(jù)庫、中國學(xué)術(shù)期刊綜合評價數(shù)據(jù)庫全文收錄。
　　【摘要】目的了解重慶市主城區(qū)嘉陵江和長江水中有機物污染狀況，評價水中有機污染物對人群健康的影響。方法固相萃取法萃取水中有機污染物，將萃取的有機污染物溶于二甲基亞砜(DMSO)中，對H4IIE細胞進行染毒，用四甲基偶氮噻唑藍(MTT)檢測水中有機污染物對H4IIE細胞增殖的抑制作用，并用熒光比色法檢測水中有機污染物對H4IIE細胞7-乙氧基-3-異吩嗯唑酮·脫乙基酶(EROD)的誘導(dǎo)作用。結(jié)果各水樣處理H4IIE細胞后，H4IIE細胞的增殖隨染毒時間和劑量的增加而呈下降趨勢。48和72h處理組200和250倍濃縮的水樣對細胞增殖有顯著抑制作用(P<0?05，與溶劑對照組比較)；2，3，7，8-四氯二苯并-對-二惡英(TCDD)對EROD誘導(dǎo)的半數(shù)有效劑量(EC50)值為4?4pg／ml，各水樣相對于2，3，7，8-TCDD的毒性當量值分別為(2004?08)大溪溝：2?2×10-4pg／L；(2004?08)寸灘：0?9×10-4pg／L；(2005?01)大溪溝：13?3×10-4pg／L；(2005?01)寸灘：3?7×10-4pg／L。結(jié)論污染物對H4IIE細胞的毒性呈現(xiàn)出時間和劑量依賴性；各水樣均可誘導(dǎo)H4IIE細胞EROD活性；同一采樣點中，枯水期水樣毒性大于豐水期水樣。

　　【關(guān)鍵詞】有機,污染物

　　重慶市是三峽庫區(qū)最大的城市，嘉陵江和長江是重慶市的主要水源，研究水中有機污染物對哺乳動物體外培養(yǎng)細胞的毒性，對于評價三峽庫區(qū)水源水對人群健康的影響十分必要。H4IIE細胞是研究有機污染物毒性常用的細胞株。本文從有機污染物對H4IIE細胞增殖的抑制和對7-乙氧基-3-異吩嗯唑酮·脫乙基酶(Ethoxy-Resorufin-O-Deethylase，EROD)的誘導(dǎo)兩方面對2004～2005年重慶市主城區(qū)長江和嘉陵江段水中有機污染物的毒性進行了分析。

　　1材料與方法

　　1?1試劑和儀器XAD-2樹脂、四甲基偶氮噻唑藍(MTT)、7-乙氧基-3-異吩嗯唑酮(Ethoxy-Resorufin，ERF)、香豆素(美國Sigma公司)；2，3，7，8四氯二苯并-對-二惡英(tetrochlorodibenzo-p-dioxins，TCDD)標準品(美國Cambrige公司)；DMEM培養(yǎng)基、小牛血清(美國Hyclone公司)；自制不銹鋼柱；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申科機械研究所)；多用途酶標儀(美國Biotech公司)。

　　1?2水中有機污染物的萃取選擇重慶市主城區(qū)大溪溝作為嘉陵江的取水點，寸灘作為長江取水點，分別于2004年8月(豐水期)和2005年1月(枯水期)進行水樣采集。在不銹鋼柱中按樹脂：江水=1∶2000(V∶V)的比例裝填已活化的XAD-2樹脂，將江水用玻璃纖維棉過濾除去水中懸浮物后通過不銹鋼柱，控制流速為0?5～1倍柱體積／min。過柱完畢，用真空泵將柱中水份吸干，用丙酮：正己烷(1∶1)洗脫XAD-2樹脂中吸附的有機污染物，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，氮氣吹干后按1ml二甲基亞砜(DMSO)中溶解50L江水中有機污染物的比例將萃取的有機污染物溶于DMSO，-20℃保存。

　　1?3MTT實驗H4IIE細胞按1×104／孔接種于96孔平底培養(yǎng)板中，放入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10％小牛血清的DMEM。加入溶于DMSO的有機污染物進行染毒，設(shè)立空白對照組、DMSO溶劑對照組、25，50，100，150，200，250倍污染物組，每個濃度每個時相點至少設(shè)6個平行孔。于暴露后的24，48，72h分別取培養(yǎng)板，將原培養(yǎng)液去除，換含20μlMTT(5mg／ml)的新鮮培養(yǎng)基200μl，再培養(yǎng)4h，去上清，加DMSO200μl／孔，振搖5min，于酶標儀上490nm下，空白調(diào)零，測Dλ值，用Excel軟件繪制細胞增殖曲線。

　　圖1不同濃度的2，3，7，8-TCDD標樣對H4IIE細胞EROD酶誘導(dǎo)的劑量-效應(yīng)曲線（略）

　　1?4EROD實驗H4IIE細胞按1×104／孔接種于96孔平底培養(yǎng)板中，放入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10％小牛血清的DMEM。當細胞達到70％融合時加入溶于DMSO的0?75～40pg／25μl的2，3，7，8-TCDD標準品，以及溶于DMSO的有機污染物進行染毒，染毒劑量分別為2?5，25，250倍污染物，加入DMSO的體積占終體積的0?5％，每個濃度每個時相點至少設(shè)6個平行孔。暴露72h后，去除原培養(yǎng)基，加入100μl新鮮的含8μmol／L的ERF和10μmol／L的香豆素的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)60min。然后，將每孔中的培養(yǎng)基移入一新的96孔板的對應(yīng)孔中，并加入130μl乙醇終止反應(yīng)。于熒光酶標儀上535nm激發(fā)波長/590nm吸收波長條件下測反應(yīng)終產(chǎn)物異吩嗯唑酮(Resorufin，RF)的熒光強度。用Origin6?0軟件制定熒光強度與2，3，7，8-TCDD濃度間的劑量-效應(yīng)曲線，并從標準曲線中求得每個水樣相對于2，3，7，8-TCDD標準品的毒性當量(toxicequivalency，TEQ)值。

　　2結(jié)果

　　2?1水中有機污染物對H4IIE細胞增殖的影響各水樣處理H4IIE細胞后，H4IIE細胞的增殖隨染毒時間和劑量的增加而呈下降趨勢，其中72h處理組劑量-效應(yīng)關(guān)系最好。在48和72h處理組200和250倍濃縮的2005年1月大溪溝水樣和2005年1月寸灘水樣對細胞增殖有抑制(P<0?05，與溶劑對照組比較)，其他各種處理與對照比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。從48和72h處理組細胞增殖曲線看，同一采樣點枯水期水樣對細胞增殖的抑制作用大于豐水期水樣，而同一采樣期大溪溝水樣與寸灘水樣對細胞增殖的抑制作用差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

　　2?2水中有機污染物對H4IIE細胞EROD的誘導(dǎo)(圖1)根據(jù)不同濃度的2，3，7，8-TCDD標樣對H4IIE細胞EROD酶誘導(dǎo)繪出劑量-效應(yīng)曲線。從標準曲線上可以求出，2，3，7，8-TCDD的EC50值為4?4pg／ml，即0?88pg／孔。250倍濃縮的(2004?08)大溪溝水樣、(2004?08)寸灘水樣、(2005?01)寸灘水樣以及25倍濃縮(2004?08)大溪溝水樣的EROD活性的誘導(dǎo)值落在此劑量-效應(yīng)曲線的線性范圍內(nèi)，從標準曲線上求得各水樣相對于2，3，7，8-TCDD標樣的TEQ值分別為(2004?08)大溪溝：2?2×10-4pg／L；(2004?08)寸灘：0?9×10-4pg／L；(2005?01)大溪溝：13?3×10-4pg／L；(2005?01)寸灘：3?7×10-4pg／L。

　　3討論

　　重慶市主城區(qū)長江和嘉陵江水中有機污染物的類型以多環(huán)芳烴類和鄰苯二甲酸酯類為主〔1〕，這些化合物在水中的含量都比較低，但考慮到這些化合物種類繁多，而且混合物之間存在疊加和增效效應(yīng)，所以有必要對水中POPs混合物的毒性效應(yīng)進行評價。MTT的檢測結(jié)果表明，H4IIE細胞的增殖隨有機提取物染毒時間和劑量的增加而呈下降趨勢。有機污染物在水中的濃度雖然很低，但由于其具有難降解性和可隨生物鏈積累的特點，使其在水生生物體內(nèi)可達到104～107倍的富集〔2〕，如此高的富集濃度對水生動植物細胞及食用水生動植物的人類細胞的毒性不容忽視。水中多種有機物，包括所有的二惡英類化合物，多氯聯(lián)苯類化合物，以及大部分的多環(huán)芳烴類化合物，它們在H4IIE細胞中有相同的信號途徑-芳烴受體途徑〔3〕。EROD法是國際上通用的檢測芳烴受體途徑活化程度的方法〔4〕，此方法利用與AHR結(jié)合能力最強的2，3，7，8-TCDD做為標準品，其他化合物的毒性以此為基準，可得出其毒性當量〔5〕。本文結(jié)果表明，長江和嘉陵江水中有機物的TEQ值均在10-4pg/L范圍，枯水期水樣毒性略大于豐水期，與文獻〔6〕結(jié)果比較類似。芳烴受體途徑的激活會導(dǎo)致動物產(chǎn)生神經(jīng)毒性、免疫功能紊亂、生殖和發(fā)育障礙以及癌變等毒性效應(yīng)〔7〕，所以應(yīng)引起足夠重視。長江和嘉陵江水中有機污染物中除了能激活H4IIE細胞的多環(huán)芳烴類化合物外，還含有較多的鄰苯二甲酸酯類化合物，此類化合物幾乎不激活動物細胞的芳烴受體途徑〔8〕。鄰苯二甲酸酯類化合物的毒性主要表現(xiàn)為雄性生殖毒性〔9〕，對水中有機污染物的雄性生殖毒性尚待進一步研究。

　　【參考文獻】

　　〔1〕田懷軍，舒為群，朱毅，等.長江、嘉陵江(重慶段)水源水及出廠水有機污染物分析［J］.長江流域資源與環(huán)境，2002，24(4):226-239.

　　〔2〕KlumpDW,HaushengH,HunmphrtC,etal.ToxiccontaminationandtheirbiologicaleffectsincoastalwatersofXiamen,China.Organicpollutantsinmusselandfishtissues［J］.MarPolluBull,2002,48:752-760.

　　〔3〕HahnME.Biomarkersandbioassaysfordetectingdioxin-likecompoundsinthemarianenvironment［J］.TheScienceoftheTotalEnvironment,2002,289:49-69.

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