本文是一篇農(nóng)業(yè)工程類論文范文，論述了響應(yīng)面法對漆斑菌液體發(fā)酵產(chǎn)膽紅素氧化酶條件的優(yōu)化，選自期刊遼寧工程技術(shù)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），本刊的前身是《阜新礦業(yè)學(xué)院學(xué)報》是遼寧省教育廳主管遼寧工程技術(shù)大學(xué)主辦，遼寧工程技術(shù)大學(xué)學(xué)報編輯部編輯出版的綜合性學(xué)術(shù)刊物。讀者對象為全國有關(guān)高校、科研單位、廠礦企業(yè)及管理部門的科研人員、工程技術(shù)人員研究生等。
　　摘要：對漆斑菌(Myrothecium sp. IMER1)菌株液體發(fā)酵產(chǎn)膽紅素氧化酶的條件進(jìn)行了優(yōu)化。采用單因素試驗篩選出最適碳源為葡萄糖，氮源為硝酸銨，pH為7，溫度為28 ℃和最有效促進(jìn)產(chǎn)酶的金屬離子為Cu2+。在此基礎(chǔ)上，利用Plackett-Burman 設(shè)計對影響產(chǎn)酶因素的效應(yīng)進(jìn)行評價，篩選出具有顯著影響的3個因素葡萄糖、pH和溫度。用最陡爬坡路徑逼近最大產(chǎn)酶區(qū)域后，利用響應(yīng)面中心組合設(shè)計對顯著因素進(jìn)行優(yōu)化，得出pH、溫度和葡萄糖分別為5.7、28 ℃、8 g/L時，優(yōu)化后液體發(fā)酵液中膽紅素氧化酶活力提高到0.627 U/mL，比未優(yōu)化前的酶活力0.214 U/mL提高了近2倍，結(jié)果表明單因素與響應(yīng)面結(jié)合法可優(yōu)化菌株IMER1液體發(fā)酵產(chǎn)膽紅素氧化酶的條件。

　　關(guān)鍵詞：膽紅素氧化酶,漆斑菌(Myrothecium sp. IMER1),Plackett-Burman設(shè)計,響應(yīng)面法

　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.031

　　Abstract：The fermentation conditions of producing bilirubin oxidase (BOX) by Myrothecium sp. IMER1 were optimized. The optimal carbon source glucose， nitrogen source NH4NO3， pH 7， 28 ℃ and metal ion Cu2+ were screened with single factorial experiments. Plackett-Burman design was used to evaluate the effects of six factors related to BOX production. Three statistically significant factors including glucose， pH and temperature were selected. The path of steepest ascent was used to approach the optimal region of BOX production subsequently. The optimal combined concentration for maximum enzyme activity was further optimized by response surface methodology and determined as follows： 5.7，28 ℃， 8 g/L. The maximum enzyme activity was 0.627 U/mL. The optimization of culture conditions of IMER1 led to about 2 fold increase in BOX enzyme activity compared with initial result 0.214 U/mL， indicating that single factor in combination with response surface methodology was an effective method for optimizing BOX enzyme activity conditions by Myrothecium sp. IMER1.

　　Key words： bilirubin oxidase; Myrothecium sp. IMER1; Plackett-Burman design; response surface methodology

　　漆斑菌屬(Myrothecium)是一種無性型絲狀真菌，屬于半知菌亞門絲孢綱絲孢目瘤座孢科(Tuberculariaceae)。漆斑菌屬是產(chǎn)膽紅素氧化酶的主要真菌，工業(yè)上常用該屬菌株生產(chǎn)膽紅素氧化酶(Bilirubin oxidase， BOX)[1]。膽紅素氧化酶是一種含銅的多酚氧化酶， 能催化膽紅素氧化， 氧氣是其電子受體。反應(yīng)過程為膽紅素氧化酶催化膽紅素生成膽綠素， 后者可進(jìn)一步氧化最終生成無色化合物[2-4]。在臨床檢驗中，常使用膽紅素氧化酶來測定血液中膽紅素的含量。相比較其他膽紅素測定方法，酶學(xué)方法具有特異性、靈敏度高和操作簡便等優(yōu)點，適用于臨床手工或自動化檢測[5，6]。近年來，由于膽紅素氧化酶的底物范圍廣和氧化能力強， 目前已被用于生物電池的制造、 污水處理等方面的研究[7-11]。

　　響應(yīng)面法是利用合理的試驗設(shè)計并通過試驗得到的一定數(shù)據(jù)，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問題的一種統(tǒng)計方法。該方法在優(yōu)化研究中應(yīng)用頻繁，是降低開發(fā)成本、優(yōu)化加工條件、提高產(chǎn)品質(zhì)量、解決生產(chǎn)過程中實際問題的一種有效方法，已廣泛地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、生物、食品、化學(xué)、制造等領(lǐng)域[12]。為了提高漆斑菌產(chǎn)BOX的能力，使其產(chǎn)酶量達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模的需求，本試驗對漆斑菌菌株Myrothecium sp.IMER1在液體培養(yǎng)體系中發(fā)酵產(chǎn)酶的影響因子進(jìn)行了研究和優(yōu)化。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料與儀器

　　供試漆斑菌IMER1，從武漢植物園土壤中分離得到;2，2-連氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸銨)(ABTS)，美國SIGMA公司;馬鈴薯液體培養(yǎng)基(PDB)：20%馬鈴薯(削片煮水)+2%葡萄糖。

　　紫外可見分光光度儀(UNICO-UV-2000型)，上海尤尼柯儀器有限公司;臺式高速冷凍離心機(jī)(TGL-16/TGL16型)，湖南湘儀集團(tuán);全溫氣浴振蕩搖床(ZD-88型)，金壇市成輝儀器廠。 　　1)回歸模型的建立及置信度分析。以BOX酶活為響應(yīng)值，根據(jù)表5的試驗結(jié)果，用SAS統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行多元回歸分析，所得的主要分析結(jié)果見表6、表7。從方差分析中可以看出，各試驗因素響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系。根據(jù)試驗因素對響應(yīng)值的影響，擬合得到多項式回歸模型為：Y1=0.642 963+0.014 722×pH+0.004 44×Glu-0.153 056×T-0.099 537×pH×pH+0.058 889×pH×Glu-0.005×pH×T-0.067 87×Glu×Glu+0.098 889×Glu×T-0.076 204×T×T。

　　從表6中可以看出，用上述回歸方程描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系時，其因變量和自變量之間的線性關(guān)系是顯著的，決定系數(shù)為98.71%，說明回歸方程的擬合程度很好。

　　2)顯著因素水平的優(yōu)化和驗證。運用SAS軟件對回歸模型進(jìn)行規(guī)范性分析，尋求最大酶活量的穩(wěn)定點及對應(yīng)的因素水平，結(jié)合圖6的回歸方程的三維響應(yīng)面圖和等高線圖可知，回歸模型存在穩(wěn)定點，對應(yīng)的pH、T、Glu實際取值分別為5.7、28 ℃、8 g/L，BOX酶活的最大估計值為0.643 U/mL。在以上優(yōu)化條件下進(jìn)行驗證試驗，共進(jìn)行3次100 mL的搖瓶試驗，BOX酶活分別為0.582、0.639、0.662 U/mL，平均值為0.627 U/mL。證明預(yù)測值0.643 U/mL與試驗平均值0.627 U/mL非常接近，同時比沒有優(yōu)化前的酶活力0.214 U/mL提高了近2倍。

　　3 小結(jié)

　　漆斑菌屬是產(chǎn)BOX的主要真菌，有關(guān)其產(chǎn)酶條件的優(yōu)化報道不多。多數(shù)微生物產(chǎn)酶條件優(yōu)化采用單因素試驗、正交試驗及響應(yīng)面試驗分析，這些方法存在一定的缺陷[14]。本試驗通過整合單因素試驗和Plackett-Burman設(shè)計，結(jié)合最陡爬坡路徑試驗和響應(yīng)面中心組合設(shè)計，對菌株Myrothecium sp.IMER1在液體培養(yǎng)體系中高效產(chǎn)膽紅素氧化酶條件進(jìn)行了優(yōu)化，獲得了比較理想的結(jié)果。菌株IMER1以PDB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在外加碳源和氮源中，葡萄糖、蔗糖和硝酸銨能提高BOX產(chǎn)量;在中性偏堿性的pH 7～9范圍內(nèi)，BOX產(chǎn)量要比在酸性條件下高，其最適產(chǎn)酶pH為7;最適產(chǎn)酶溫度為28 ℃;在培養(yǎng)基中加入Cu2+對產(chǎn)BOX有明顯的促進(jìn)作用。運用響應(yīng)面法優(yōu)化液體體系產(chǎn)BOX酶的條件，結(jié)果表明，在pH、溫度、Cu2+、碳源和氮源等影響因素中，pH、溫度和碳源屬于主效因子。當(dāng)pH、溫度和葡萄糖分別為5.7、28 ℃、8 g/L時，酶活力可達(dá)到最大優(yōu)化值，比沒有優(yōu)化前的酶活力量提高近2倍。

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